淋病奈瑟菌耐藥性與耐藥基因的研究進(jìn)展

劉蓉華(綜述)，張 雷(審校)

(云南大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000)

淋病是目前世界上流行的性傳播疾病之一，淋病奈瑟菌為其病原體。據(jù)WHO估計(jì)，全球每年新發(fā)病例超過6000萬。由于抗生素的不合理使用，淋病奈瑟菌對(duì)其產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。Ray等［1］報(bào)道，在斯里蘭卡，淋病奈瑟菌對(duì)青霉素的耐藥率高達(dá)96.8%，8.2%的淋病奈瑟菌耐四環(huán)素;在孟加拉，耐青霉素的淋病奈瑟菌達(dá)到33%，耐四環(huán)素的菌株達(dá)到50%，76%的菌株耐環(huán)丙沙星。我國(guó)各地的淋病奈瑟菌耐藥也均有報(bào)道，山西大同地區(qū)2009年有77%的淋病奈瑟菌耐青霉素，93%耐四環(huán)素，而淋病奈瑟菌對(duì)環(huán)丙沙星100%耐藥［2］。廣州地區(qū)2005～2009年間淋病奈瑟菌對(duì)青霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、大觀霉素、頭孢曲松的耐藥率分別為 59.38%、59.38%、66.41%、0.79%、1.56%［3］。新疆地區(qū)2007年淋病奈瑟菌對(duì)青霉素、頭孢曲松、阿奇霉素的耐藥率分別為57.1%、28.6%、33.2%［4］?？梢姡懿∧紊哪退幀F(xiàn)象已十分普遍，淋病奈瑟菌的耐藥也成為淋病防治工作中的一大難題?，F(xiàn)將近年來淋病奈瑟菌的耐藥性及其耐藥基因的研究進(jìn)展綜述如下。

1 penA基因和ponA基因突變導(dǎo)致青霉素類耐藥

淋病奈瑟菌上的青霉素結(jié)合蛋白(penicillinbinding protein，PBPs)是青霉素的主要結(jié)合靶點(diǎn)。青霉素含有β-內(nèi)酰胺，β-內(nèi)酰胺是通過與PBPs共價(jià)結(jié)合而阻止細(xì)胞壁的合成來殺滅淋病奈瑟菌。Powell等［5］研究表明，淋病奈瑟菌可產(chǎn)生4種分子質(zhì)量的PBPs:兩種高分子質(zhì)量的A類PBP1和B類PBP2;兩種低分子質(zhì)量的 C類 PBPs:PBP3和PBP4［5］。PBP1和 PBP2是β-內(nèi)酰胺類抗生素最主要的結(jié)合靶位點(diǎn)，尤其是PBP2，染色體介導(dǎo)的淋球菌對(duì)青霉素的耐藥部分是由于PBP2突變所引起。編碼PBP2的基因penA基因出現(xiàn)點(diǎn)突變，在氨基酸排列第345號(hào)和第 346號(hào)位置中插入一個(gè)天冬氨酸(Asp-345a)，同時(shí)該蛋白的C末端發(fā)生4～6個(gè)氨基酸的替換，導(dǎo)致PBP2結(jié)構(gòu)的改變。青霉素作用的另一靶位是PBP1，PBP1是由ponA基因編碼的。如果PBP1氨基端第40位氨基酸突變，則淋球菌對(duì)青霉素的最低抑菌濃度≥1 g/L，與野生菌株相比，耐藥菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性降低［6］。penA基因和ponA基因的突變都會(huì)導(dǎo)致其編碼的PBPs相應(yīng)氨基酸序列的改變，使β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)淋球菌的?；俣冉档?，增強(qiáng)淋球菌的耐藥性。

2 gyrA基因、parC基因和norm基因的突變引起氟喹諾酮類耐藥

淋病奈瑟球菌DNA的復(fù)制和重組需要螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶，同時(shí)，這兩種酶也是淋病奈瑟菌生長(zhǎng)所必需的酶。氟喹諾酮類藥物可以通過抑制螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用而起到抑菌作用。編碼這兩種酶的基因發(fā)生點(diǎn)突變，形成新的氨基酸，將影響喹諾酮類藥物與淋病奈瑟菌上靶位的正常結(jié)合，降低了細(xì)菌的敏感性，淋病奈瑟菌的耐藥性也隨之形成［7］。早年國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn)，淋病奈瑟菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥與編碼DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的gyrA基因和parC基因上的一段核苷酸序列的突變有關(guān)(DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞單位由gyrA基因編碼，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的C亞單位由parC基因編碼)，該基因突變位點(diǎn)集中發(fā)生在該核苷酸序列N端199～318區(qū)間內(nèi)，該區(qū)域稱為氟喹諾酮耐藥決定區(qū)［8］。

廖經(jīng)忠等［9］對(duì)淋球菌喹諾酮類藥物作用靶位編碼基因gyrA和parC的喹諾酮耐藥決定區(qū)進(jìn)行了聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增和直接測(cè)序分析，分別用氧氟沙星、氟羅沙星、洛美沙星、依諾沙星這4種喹諾酮類抗生素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淋病奈瑟菌對(duì)環(huán)丙沙星敏感的淋病奈瑟菌株gyrA基因和parC基因均未發(fā)生突變，而中介菌株或耐藥菌株均出現(xiàn)gyrA基因突變或同時(shí)伴有parC基因突變，并且所有parC基因突變均發(fā)生在gyrA基因突變的基礎(chǔ)上。gyrA基因發(fā)生了Ser91→Tyr、Ser91→Phe、Asp95→Gly、Asp95→Ala、Asp95→Asn等基因的突變，parC基因發(fā)生了Gly85→Cys、Asp86→Asn、Ser87→Arg、Ser87→Ile、Ser87→Asn、Ser88→Pro、Glu91→Lys、Glu91→Gly等基因的突變，突變頻率最高的為gyrA:Ser91→Phe。與喹諾酮類耐藥性相關(guān)的淋病奈瑟菌基因還有g(shù)yrB和parE等，喹諾酮的高度耐藥是由gyrA基因的突變引起，而低度耐藥主要是由gyrB基因的突變引起。

Norm系統(tǒng)也參與調(diào)節(jié)喹諾酮類抗生素的耐藥。Norm基因介導(dǎo)的抗生素耐藥發(fā)生在其啟動(dòng)子235區(qū)域，該區(qū)域發(fā)生的點(diǎn)突變可增強(qiáng)淋病奈瑟菌對(duì)喹諾酮類抗生素的耐藥性［10］。

3 藥物外排機(jī)制導(dǎo)致多重抗生素通透性降低

隨著抗生素的廣泛使用，越來越多的淋病奈瑟菌已不對(duì)單一抗生素敏感，出現(xiàn)對(duì)多種抗生素同時(shí)耐藥的現(xiàn)象，即多重耐藥性，且有從低水平耐藥向高水平耐藥發(fā)展的趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)外的研究均表明，淋病奈瑟菌的多重耐藥性與其多重傳遞耐藥(multiple transferable resistance，MTR)系統(tǒng)的基因突變引起的藥物外排機(jī)制有關(guān)［11］。近年的研究表明，引起淋病奈瑟菌多重耐藥的基因主要有mtrR基因和mtrF基因。

mtrR基因系統(tǒng)主要包括mtrR基因和mtrCDE基因。mtrCDE基因位于mtrR基因的下游，主要在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮其調(diào)節(jié)機(jī)制。mtrCDE啟動(dòng)子區(qū)有一段長(zhǎng)度為26 bp的區(qū)域，該區(qū)域中有mtrR的啟動(dòng)子35區(qū)，mtrR與mtrCDE就在該區(qū)域結(jié)合［12］。mtrCDE編碼mtrC基因、mtrD基因和mtrE基因，此三者形成一個(gè)完整的三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。mtrR編碼一種含有210個(gè)氨基酸的阻遏蛋白，該阻遏蛋白能夠與mtrC基因上轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子結(jié)合。mtrR基因的突變可以使其下游的mtrCDE基因的轉(zhuǎn)錄開放，mtrCDE基因編碼的外膜蛋白復(fù)合物增多，外排物質(zhì)相應(yīng)增多。淋病奈瑟菌的外排系統(tǒng)是由細(xì)胞膜上的脂蛋白在ATP酶的催化下完成的，該主動(dòng)外排系統(tǒng)能夠泵出疏水性的去污劑類、膽鹽和脂溶性抗生素等疏水性因子，引起淋病奈瑟菌的耐藥性。另有研究表明，淋病奈瑟菌mtrR基因的突變主要表現(xiàn)為3種形式:第45位的Gly(GGC→GAC)Asp、第14位的His(CAC→CGC)Arg和第51位的Phe(TTC→GTC)Val［13］。第45位和第51位的氨基酸位于DNA結(jié)合蛋白α-螺旋-轉(zhuǎn)折-α-螺旋的超二級(jí)基序的第二個(gè)α-螺旋，mtrR基因的突變導(dǎo)致此螺旋的破壞，從而使mtrR與mtrCDE的結(jié)合力下降，mtrR基因的阻遏作用減弱，增加了淋病奈瑟菌對(duì)抗生素的耐藥性［14］。

在mtrR基因的啟動(dòng)子區(qū)，有一個(gè)13 bp的回文序列，該序列基因的突變也會(huì)導(dǎo)致淋病奈瑟菌耐藥性的產(chǎn)生。該序列不受mtrR基因的調(diào)控，主要突變?yōu)樾问綖?mtrR啟動(dòng)子區(qū) 13 bp回文序列 5' AAAAAGTCTTTTT3'的5'端發(fā)生了一個(gè)T/A堿基的缺失。王東梅等［15］對(duì)32株淋病奈瑟菌進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中的13株有此突變，可見13 bp回文序列與淋病奈瑟菌的耐藥性也有密切關(guān)系。

在淋病奈瑟菌的多重耐藥性中，mtrF基因也發(fā)揮著重要作用。mtrF基因位于mtrR基因下游的22 bp處，與mtrCDE外排泵的關(guān)系密切［16］。王冬梅等［15］根據(jù)淋病奈瑟菌MIC的不同，用瓊脂擴(kuò)散敏感試驗(yàn)法把32株臨床菌種分為敏感組、低中等水平多重耐藥組和高度多重耐藥組，并用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)3組中mtrF基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示:高度多重耐藥組中mtrF基因的表達(dá)量明顯多于敏感組和低中等水平多重耐藥組，推測(cè)mtrF基因可能參與淋病奈瑟菌高水平的多重耐藥，而mtrR基因只參與淋病奈瑟菌基礎(chǔ)水平的多重耐藥。mtrF基因介導(dǎo)的淋病奈瑟菌高度多重耐藥機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

淋病奈瑟菌對(duì)抗生素的外排機(jī)制也與淋病奈瑟菌細(xì)胞膜上的Far系統(tǒng)有關(guān)。Far系統(tǒng)發(fā)揮作用需依靠淋病奈瑟菌的外膜通道蛋白mtrE，該系統(tǒng)對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸有耐受性，且該系統(tǒng)受到外膜通道蛋白mtrE的調(diào)控［17］。

4 質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥與TEM-1基因和tetM基因的關(guān)系

淋病奈瑟菌的耐藥質(zhì)粒迄今為止發(fā)現(xiàn)有2.6×106的隱蔽性質(zhì)粒、耐青霉素質(zhì)粒(2.9×106的里約型、3.5×106的多倫多型、3.2×106的非洲型、4.0×106的尼姆斯型、6.0×106的新西蘭型及4.4× 106的亞洲型)、25.2×106的耐四環(huán)素質(zhì)粒和24.5×106的接合型質(zhì)粒。王德霞等［18］用堿裂解法抽提質(zhì)粒，對(duì)江蘇省揚(yáng)州地區(qū)淋病奈瑟菌耐藥質(zhì)粒譜進(jìn)行研究，并對(duì)所抽提質(zhì)粒分子質(zhì)量的大小進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果:含4.4×106的“亞洲型”耐青霉素質(zhì)粒占73.7%?？梢?，我國(guó)介導(dǎo)質(zhì)粒耐藥的主要為亞洲型。淋病奈瑟菌的耐藥質(zhì)?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)化和接合兩種方式在菌株間傳遞。淋病奈瑟菌的耐藥質(zhì)粒又稱R質(zhì)粒，能夠編碼合成破壞抗生素的酶。另有一種為F質(zhì)粒，它所編碼的蛋白質(zhì)能夠使兩個(gè)細(xì)菌間接合，進(jìn)而傳遞細(xì)菌間的遺傳物質(zhì)。淋病奈瑟菌間的耐藥R質(zhì)粒正是通過F質(zhì)粒進(jìn)行傳遞。

淋病奈瑟菌耐青霉素質(zhì)粒中含teM-1基因，該基因主要以轉(zhuǎn)座子TnA基因的形式存在于淋病奈瑟菌的耐藥質(zhì)粒中，并通過接合和轉(zhuǎn)化的方式在細(xì)菌間傳遞［19］。teM-1基因可編碼 β-內(nèi)酰胺酶，該酶以β-內(nèi)酰胺環(huán)為底物，使青霉素類抗生素的抗菌作用減弱。25.2×106的耐四環(huán)素質(zhì)粒和24.5×106的結(jié)合型質(zhì)?？赡芘c介導(dǎo)四環(huán)素高水平耐藥有關(guān)。25.2×106質(zhì)粒帶有tetM決定簇，tetM基因所編碼的胞質(zhì)蛋白能夠抑制四環(huán)素類藥物對(duì)細(xì)菌核糖體的毒性作用，使淋病奈瑟菌對(duì)四環(huán)素類藥物產(chǎn)生高度耐藥［20］。帶有該基因的質(zhì)粒不僅能在淋病奈瑟菌間進(jìn)行傳遞，還可以在多種革蘭陽性和陰性細(xì)菌間傳遞，從而產(chǎn)生多重耐藥和交叉感染［21］。

5 erm基因的出現(xiàn)引起阿奇霉素耐藥

近年出現(xiàn)了淋病奈瑟菌對(duì)阿奇霉素耐藥的現(xiàn)象，其原因可能為erm基因的出現(xiàn)。erm基因編碼erm酶，此酶可使rRNA自動(dòng)甲基化，引起阿奇霉素類抗生素的作用靶位——核糖體50S亞基蛋白發(fā)生改變，降低50S亞基蛋白與阿奇霉素類藥物的親和力，導(dǎo)致阿奇霉素類抗生素耐藥性的產(chǎn)生［22］。

6 spe位點(diǎn)的突變引起大觀霉素耐藥

臨床上耐大觀霉素類淋病奈瑟菌株少見，但近年也出現(xiàn)了淋病奈瑟菌耐大觀霉素的報(bào)道。研究表明，其耐藥機(jī)制可能是淋病奈瑟菌染色體上spe位點(diǎn)突變，使其編碼的30S核糖體亞單位結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，從而降低了大觀霉素類抗生素與淋病奈瑟菌的親和力［23］。

綜上所述，淋病奈瑟菌對(duì)抗生素的耐藥情況日益嚴(yán)峻，對(duì)青霉素、四環(huán)素、喹諾酮等藥物已基本上全部耐藥，對(duì)現(xiàn)今一線藥物大觀霉素類抗生素也逐漸出現(xiàn)耐藥菌株，隨著抗生素的廣泛使用，耐藥情況會(huì)越來越嚴(yán)重，因此要加強(qiáng)淋病奈瑟菌耐藥性的研究，并根據(jù)其耐藥機(jī)制對(duì)淋病奈瑟菌進(jìn)行針對(duì)性處理，如改變淋病奈瑟菌的耐藥基因序列，消除耐藥質(zhì)粒;臨床上根據(jù)耐藥機(jī)制的不同采取不同的給藥措施，如對(duì)于penA和ponA改變的菌株，可用喹諾酮類藥物進(jìn)行治療;對(duì)于主動(dòng)外排機(jī)制引起的耐藥菌株，可應(yīng)用能量抑制劑抑制其外排蛋白的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)等，以此來降低淋病奈瑟菌耐藥性的發(fā)生。因此，科研上應(yīng)著力研究淋病奈瑟菌耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制，尤其是在分子水平上進(jìn)行研究，以期能夠研究出解決淋病奈瑟菌耐藥的方法，并為今后抗生素的研制提供合理依據(jù)。

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