海南番木瓜總皂苷的提取工藝研究

李玉萍，賈桂云

（海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 海口 571158）

海南番木瓜總皂苷的提取工藝研究

李玉萍，賈桂云*

（海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158）

研究了海南番木瓜總皂苷的提取工藝.以齊墩果酸為對(duì)照品，采用紫外分光光度法在545 nm處測(cè)定海南番木瓜總皂苷的含量，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝.結(jié)果表明：用75%的乙醇，pH=7,溫度為70℃，提取時(shí)間為120 min，海南番木瓜總皂苷的提取率最高，為2.66%.

番木瓜；總皂苷；提取工藝；正交試驗(yàn)

番木瓜（Carica Papaya）又名木瓜、番瓜、萬(wàn)壽果等，原產(chǎn)于熱帶美洲和非洲，后來(lái)引種到我國(guó)[1]，主要分布在廣東、海南、廣西、云南、福建、臺(tái)灣省等.成熟的木瓜做水果，其果肉鮮紅厚實(shí)、營(yíng)養(yǎng)豐富，糖分、胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、維生素等含量較高.除食用外，木瓜還有很高的藥用價(jià)值.據(jù)《本草綱目》、《本草遺拾》等記載，木瓜具有舒經(jīng)絡(luò)、和脾胃、易筋骨等作用，治療腰膝疼痛、腳氣水腫的功效尤為顯著.

木瓜的主要成分有三萜皂苷類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、多糖等化學(xué)成分[2].目前研究已分離、鑒定了三萜皂苷類(lèi)的單體有：齊墩果酸、乙酰熊果酸、3-O-乙酰坡模醇酸、樺木酸.木瓜中主要藥效成分齊墩果酸，已被現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明為五環(huán)三萜類(lèi)皂苷元，具有護(hù)肝降酶、抗炎、促免疫、降血脂、降血糖、抗菌、抗腫瘤等生理活性[3-7].

本文對(duì)海南番木瓜總皂苷成分的提取工藝，對(duì)開(kāi)發(fā)利用海南番木瓜具有一定的科學(xué)意義.

1 儀器、材料與試劑

1.1 儀器

TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；FZ-102型微型植物粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限責(zé)任公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SB-5200DTD超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限責(zé)任公司）；TP-214電子天平（丹佛儀器有限公司）.

1.2 材料

新鮮青木瓜購(gòu)于?？诮鸹ㄊ袌?chǎng).木瓜去籽洗凈，切片，40℃烘干，粉碎為供試樣品.

1.3 試劑

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（上海順勃生物工程有限公司）；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 木瓜總皂苷含量的測(cè)定方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品10.6 mg，用無(wú)水乙醇溶解，定容至50 mL.配成濃度為212 μg/mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液.

2.1.2 樣品溶液的制備

稱(chēng)取一定量的干木瓜粉于圓底燒瓶中，按1∶10的比例加入乙醚，水浴加熱回流脫脂兩次，每次2 h，溫度控制在40℃～50℃.抽濾，脫脂后的木瓜粉烘干備用.

精密稱(chēng)取1.0008 g脫脂后的木瓜粉，按料液比為1∶20，加入60%的乙醇20 mL，在60℃水浴中浸提兩次,每次2 h.合并提取液、抽濾，濾液在0～5℃冷藏24 h后，真空濃縮至膏狀.加入25 mL水復(fù)溶，抽濾，濾液用水飽和的正丁醇萃取，每次25mL，反復(fù)萃取至正丁醇層呈無(wú)色為止.合并正丁醇層，用少量水洗滌2次，真空濃縮至干.用無(wú)水乙醇定容100 mL.

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

分別吸取0.2 mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液于具塞試管中，70℃水浴揮干溶劑.加入新配制的5%的香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL，再加入0.8 mL高氯酸溶液，于70℃水浴中加熱15 min，取出，流水冷卻10 min，使之反應(yīng)完全.加入4 mL乙酸乙酯[8]，搖勻.以隨行試劑作空白，在450～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長(zhǎng).結(jié)果見(jiàn)圖1.

圖1 波長(zhǎng)掃描曲線圖Fig.1Wavelength scanning curve

從圖1可知，在545 nm處，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液有最大吸收峰，樣品有較強(qiáng)吸收.故選擇545 nm作為測(cè)定波長(zhǎng).

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和回歸方程的建立

精密吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7mL于具塞試管中，按2.1.3項(xiàng)下方法，在545 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，齊墩果酸的加入量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2.

圖2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of oleanolic acid

回歸方程：Y=0.00971X-0.00258相關(guān)系數(shù)r=0.99904，方程在0～140 ug范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系.

2.1.5 總皂苷含量的測(cè)定

精密吸取0.2 mL樣品溶液于具塞試管中，按2.1.3項(xiàng)下的方法在545 nm處測(cè)吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品溶液中總皂苷濃度為200.1 μg/mL，按下式計(jì)算其提取率.

式中：C為總皂苷濃度（μg/mL）；V為提取液的總體積（mL）；W為所用脫脂木瓜粉的質(zhì)量（g）.

2.2 方法考查

2.2.1穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取0.2 mL樣品溶液，每隔10 min測(cè)一次吸光度，計(jì)算RSD（結(jié)果見(jiàn)表1）.

表1穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab.1 Stability test

結(jié)果表明，在1 h內(nèi)樣品的吸光度變化不大，基本穩(wěn)定，RSD=1.31%.

2.2.2精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取0.2 mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，共5份，測(cè)吸光度，計(jì)算RSD值（結(jié)果見(jiàn)表2）.

表2 精密度試驗(yàn)Tab.2 Precision test

計(jì)算RSD=0.96%，表明該方法的精密度好.

2.2.3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

吸取0.1～0.5 mL樣品溶液5份，分別加入0.1 mL（21.2 μg）齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)吸光度，計(jì)算濃度，并按下式計(jì)算回收率和RSD值（結(jié)果見(jiàn)表3）.

表3 加樣回收試驗(yàn)Tab.3Recovery test

計(jì)算平均回收率為100.42%，RSD=1.15%，該方法的測(cè)定結(jié)果可靠.

2.3 海南木瓜總皂苷的提取工藝研究

影響皂苷提取主要因素的有：溫度、時(shí)間、溶劑濃度、料液比、pH值等.為研究各個(gè)因素對(duì)總皂苷提取率的影響，進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn).

2.3.1溫度對(duì)提取率的影響

精確稱(chēng)取1.000 g脫脂干木瓜粉5份，按料液比1∶20加入60%乙醇，分別在40℃、50℃、60℃、70℃，80℃下浸提90 min，溫度對(duì)總皂苷的提取率的影響見(jiàn)圖3.

從圖3可以看出，隨著溫度的升高，皂苷的提取率逐漸增大，在70℃時(shí)達(dá)到最大，繼續(xù)增加溫度，皂苷的提取率有所下降.最佳提取溫度為70℃.2.3.2浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖3 溫度對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction rate

精確稱(chēng)取1.000 g脫脂干木瓜粉5份，按料液比1∶20加入60%乙醇，在70℃下分別浸提30 min、60 min、90 min、120 min及150 min.浸提時(shí)間對(duì)總皂苷的提取率的影響見(jiàn)圖4.

圖4 浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of extracting time on extraction rate

從圖4可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，總皂苷的提取率不斷增加，120 min時(shí)達(dá)到最大，之后總皂苷的提取率趨緩緩下降.最佳提取時(shí)間為120 min.

2.3.3 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

精確稱(chēng)取1.000 g脫脂干木瓜粉5份，分別加入濃度為30%、45%、60%、75%及90%的乙醇，料液比為1∶20，在70℃下分別浸提120 min.乙醇濃度對(duì)總皂苷的提取率的影響見(jiàn)圖5.

從圖5可以看出，隨著乙醇濃度的增加，皂苷的提取率也在增加，乙醇濃度達(dá)到75%時(shí)浸出率最大，但濃度繼續(xù)增大皂苷的提取率反而會(huì)下降.這主要與木瓜皂苷的極性有關(guān)，根據(jù)相似相容原理，宜選擇75%的乙醇為最佳提取劑濃度.

2.3.4 料液比對(duì)提取率的影響

精確稱(chēng)取1.000 g脫脂干木瓜粉5份，分別按料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 加入 75%的乙醇，在70℃下分別浸提120 min，料液比對(duì)總皂苷的提取率的影響見(jiàn)圖6.

乙醇濃度/%圖5 乙醇濃度對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of concentration ofethanol on extraction rate

圖6 料液比對(duì)提取率的影響Fig.6 Effect of the ratio of solid to liquid on extraction rate

從圖6可以看出，隨著料液比的增加，皂苷的提取率有所增加，但增加的幅度不大.料液比過(guò)大，消耗溶劑多，濃縮工藝中也會(huì)更耗時(shí)耗能，因此最佳料液比1∶20.

2.3.5 pH對(duì)提取率的影響

精確稱(chēng)取1.000 g脫脂干木瓜粉5份，按料液比1∶20加入75%的乙醇，分別調(diào)節(jié)pH為3、5、7、9、11浸提120 min.pH對(duì)總皂苷的提取率的影響見(jiàn)圖7.

圖7可以看出，pH對(duì)皂苷提取率的影響很大，pH=7時(shí)，皂苷提取率最高.

2.3.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)

為考察各個(gè)因素的影響程度和交互作用，選擇對(duì)皂苷提取影響較大的四個(gè)因素，每個(gè)因素選擇三個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn).因素水平見(jiàn)表6，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7.

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)海南番木瓜總皂苷提取影響程度為：C＞D＞A＞B，即乙醇濃度＞pH＞ 溫度＞時(shí)間.最佳提取條件為：C2D2A2B3，即溫度70℃，時(shí)間120 min，乙醇濃度為75%，pH=7.在此條件下做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得提取率為2.66%.

圖7 pH對(duì)提取率的影響Fig.7 Effect of pH on extraction rate

表4 因素水平表Tab.4Actors and levels

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of orthogonal test

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)先用乙醚將木瓜粉脫脂，再用正丁醇反復(fù)萃取，從而減少了木瓜中其它成分的干擾.用紫外分光光度法進(jìn)行了比色分析，由于比色法對(duì)于結(jié)構(gòu)相近的物質(zhì)，顯色靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，而且重現(xiàn)性較好，故適用于總皂苷的含量測(cè)定.

海南番木瓜的化學(xué)成分較復(fù)雜，具有多種生物活性，故對(duì)海南番木瓜的有效部位總皂苷的研究具有較大意義.本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)法，篩選出海南番木瓜總皂苷的最佳提取工藝，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)海南番木瓜皂苷的藥用價(jià)值提供了依據(jù).

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Study on Extraction Technology of the Total Sponins from Carica Papaya in Hainan

LI Yuping，JIA Guiyun＊
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou571158，China）

A extraction technology for the total saponin of Hainan Carica Papaya was studied.Total saponin was deter?mined at 545 nm by spectrophotometry with oleanolic acid as standard control.The optimum extraction technology was determined by single factor and orthogonal experiment.The results showed that with 75%ethanol as extracting solvent at pH value of 7 and extraction temperature of 70 ℃,the ratio of solid to liquid of 1∶20,extracting time of 120min，can get the best extraction rate of 2.66%.

Carica Papaya；Total saponin；Extraction Technology；orthogonal experiment

TS 201.2

A

1674-4942（2011）03-0297-04

2011-04-21

*通訊作者

畢和平