杜氏鹽藻鞭毛相關(guān)蛋白cDNA片段的克隆及在鞭毛重吸收過程中的表達*

李 靚，石 科，李俊平，柴丹丹，薛樂勛

鄭州大學(xué)生物工程系細胞生物學(xué)研究室鄭州 450001

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤標志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻鞭毛相關(guān)蛋白cDNA片段的克隆及在鞭毛重吸收過程中的表達*

李 靚，石 科，李俊平，柴丹丹，薛樂勛#

鄭州大學(xué)生物工程系細胞生物學(xué)研究室鄭州 450001

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤標志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

系列研究簡介

薛樂勛教授課題組2000年以來主持承擔(dān)多項與杜氏鹽藻(Dunaliella salina，以下簡稱鹽藻)分子生物學(xué)相關(guān)的國家及省部級項目，主要包括:國家重點科技攻關(guān)項目、國家國際科技合作項目、國家自然科學(xué)基金項目(7項)、國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863)項目、教育部科學(xué)技術(shù)研究重點項目、教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目、河南省重大科技攻關(guān)項目、河南省杰出人才創(chuàng)新基金項目、“十·五”及“211工程”重點學(xué)科建設(shè)項目等。該課題組前期的研究結(jié)果顯示，通過鞭毛來探討鹽藻的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或相關(guān)蛋白功能有獨特的優(yōu)點:①鹽藻鞭毛伸展于鹽藻細胞表面，易于在顯微鏡下實時動態(tài)觀察鞭毛表型和功能的變化。②鹽藻無細胞壁，對極端環(huán)境具有高適應(yīng)性，培養(yǎng)方法簡單，可以通過簡單的生化方法來分離鞭毛。③已建立的鹽藻轉(zhuǎn)化體系便于進行插入突變，從而用于鞭毛表型突變和功能的研究。④鹽藻通常為無性繁殖，基因組呈單倍體，利于進行表型的遺傳分析。⑤與衣藻相比，鹽藻無細胞壁的細胞結(jié)構(gòu)更接近于哺乳動物細胞。鹽藻的這些特點使它成為一個有價值的模式生物。利用分子細胞生物學(xué)技術(shù)和方法對鹽藻鞭毛信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)機制進行研究，將加深對某些疾病復(fù)雜發(fā)生機制的理解。

該期發(fā)表的系列文章為薛樂勛教授課題組近期的研究進展，該系列研究涉及鞭毛/纖毛的結(jié)構(gòu)和功能研究，主要包括:①用反轉(zhuǎn)錄PCR及巢式擴增得到了鹽藻鞭毛相關(guān)蛋白(FAP)的一段cDNA序列，并對該基因在秋水仙堿處理后表達量的變化進行觀察，為擴增其cDNA全長并進一步研究該基因在鞭毛重吸收過程中的功能打下基礎(chǔ)。②FK506結(jié)合蛋白(FKBP)廣泛存在于真核及原核生物中，參與調(diào)節(jié)激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并在非生物脅迫及其抗逆性中起到重要作用。實驗觀察了秋水仙堿處理后鹽藻FKBP mRNA表達量的變化，指出FKBP與細胞內(nèi)和鞭毛微管解組裝過程有關(guān)，這為進一步研究FKBP在鞭毛解組裝中的功能提供了依據(jù)。③鞭毛驅(qū)動蛋白首先是從海膽胚胎獲得的，它作為一個正向末端的微管動力蛋白包括兩個驅(qū)動蛋白亞基FLA10、FLA8和一個非動力結(jié)合亞基KAP三個亞單位。作者采用反轉(zhuǎn)錄PCR及巢式擴增得到3’RACE和5’RACE的方法擴增鹽藻FLA8基因的全長序列及相關(guān)信息，為下一步研究FLA8基因在鹽藻鞭毛再生過程中的作用以及鹽藻FLA8蛋白的純化與結(jié)晶奠定了基礎(chǔ)。④藻類驅(qū)動蛋白鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(KCBP)馬達區(qū)(KMD)的晶體結(jié)構(gòu)至今未見報道。該研究中構(gòu)建了鹽藻KMD基因原核表達載體，表達純化了KMD，為解析其晶體結(jié)構(gòu)打下基礎(chǔ)。⑤運用酵母雙雜交方法研究與stt3a相互作用的蛋白，有利于進一步研究鹽藻的耐鹽機制和stt3a直接或間接參與鹽藻鞭毛再生過程中所需相關(guān)蛋白的糖基化修飾，為研究鹽藻耐鹽機制的分子通路和鞭毛再生的機制提供了實驗依據(jù)。

課題組目前正在探討鞭毛相關(guān)基因在食管鱗狀細胞癌生長、浸潤和轉(zhuǎn)移中的作用，以期證實腫瘤發(fā)生與纖毛相關(guān)的新學(xué)說。

杜氏鹽藻;鞭毛相關(guān)蛋白;秋水仙堿

目的:克隆杜氏鹽藻鞭毛相關(guān)蛋白(FAP)的cDNA片段并探討其功能。方法:分析萊茵衣藻等生物的FAP同源蛋白的氨基酸序列保守區(qū)域，設(shè)計簡并引物。提取鹽藻總RNA進行RT-PCR。根據(jù)得到的序列設(shè)計3’RACE引物，巢式PCR擴增該cDNA的3’端序列。秋水仙堿處理對數(shù)生長期的鹽藻細胞，使細胞停留在分裂中期，并誘導(dǎo)鞭毛縮短，半定量PCR檢測FAP基因的表達情況。結(jié)果:RT-PCR和3’RACE分別得到長1 535 bp和782 bp的cDNA片段，拼接后總長2 141 bp，編碼541個氨基酸。序列比對發(fā)現(xiàn)與萊茵衣藻的FAP(88%)、團藻CDC48 (89%)氨基酸序列均有較高的同源性。秋水仙堿處理后鹽藻細胞FAP mRNA表達量高于未處理對照組(F組間=43.192，P＜0.001;F時間=2.659，P=0.043;F交互=594.419，P＜0.001)。結(jié)論:成功獲得杜氏鹽藻FAP的cDNA片段，該基因在秋水仙堿誘導(dǎo)的鞭毛重吸收過程中表達量增高。

鞭毛相關(guān)蛋白(flagella associated protein，F(xiàn)AP)最早在對萊茵衣藻基因組學(xué)研究時被發(fā)現(xiàn)，對衣藻鞭毛的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示該蛋白存在于衣藻的鞭毛中［1-2］，但對其功能的研究到目前還未見報道。經(jīng)BLAST比對萊茵衣藻FAP是AAA(ATPase associated with various cellular activities)超家族成員之一，能利用ATP水解提供能量，與團藻等生物的CDC48具有很高的同源性［3］。CDC48-泛素-蛋白酶體通過降解CDK的抑制因子Farlp而參與酵母有絲分裂G1期起始點的控制［4］。在哺乳動物細胞中，CDC48的同源物VCP在泛素化所介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑中發(fā)揮重要作用［5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)擬南芥的CDC48在細胞的分裂過程中定位在細胞板處，推測該蛋白可能參與新細胞壁的形成。杜氏鹽藻是一種低等的單細胞綠色藻類，無細胞壁，有一對等長的鞭毛。其生長周期短，培養(yǎng)條件簡單，可作為研究鞭毛的有力工具［7］。作者設(shè)計簡并引物以及3’RACE引物，用反轉(zhuǎn)錄PCR及巢式擴增得到了杜氏鹽藻FAP的一段cDNA序列，并對秋水仙堿處理后表達量的變化進行了追蹤［8-9］，為擴增其cDNA全長并進一步探索該基因的功能提供了幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑 杜氏鹽藻UTEX-LB-1644購自美國得克薩斯大學(xué)，大腸桿菌DH5α為實驗室保存，Trizol購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自FERMENTAS公司，F(xiàn)irst Choice RLM-RACE Kit購自Ambion公司，LA Taq DNA聚合酶、EcoRⅠ、HindⅢ等DNA限制性內(nèi)切酶、pMD19-T載體、凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購自大連寶生物工程公司(TaKaRa)。

1.2 杜氏鹽藻FAP cDNA片段的擴增

1.2.1 杜氏鹽藻總RNA的提取及cDNA制備 將杜氏鹽藻細胞接種于UTEX液體培養(yǎng)基中(5×105mL－1)，以26℃、光暗各12 h的條件培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取鹽藻細胞，用Trizol法提取其總RNA，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳及A(260 nm)/A(280 nm)檢測RNA的質(zhì)量和濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，得到的 cDNA第一鏈于 －20℃保存待用。

1.2.2 簡并引物的設(shè)計 在GenBank中搜索萊茵衣藻FAP，團藻、小球藻等的CDC48氨基酸序列，比對分析找到兩段保守性較高的序列設(shè)計簡并引物。上游引物:5’-TA(C/T)GA(A/G)TT(C/T)GT(A/ G/C/T)GT(A/G/T/C)-3’，下游引物:5’-(A/G/C/ T)AC(A/G)AA(C/T)TC(A/G)TC(A/G)TC-3’，產(chǎn)物大小1 535 bp，引物由博尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增 以制備的杜氏鹽藻cDNA第一鏈為模板，用合成的簡并引物擴增。PCR體系:模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，dNTP (10 mmol/L)8 μL，10×LA Buffer 10 μL，LA Taq 0.5 μL，H2O 76.5 μL，共100 μL。PCR反應(yīng)條件: 94℃4 min;94℃30 s，55～65℃30 s，72℃3 min，30個循環(huán);72℃10 min，4℃終止。

1.2.4 序列分析 PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，所得條帶膠回收后與pMD19-T連接(PMD19-T-FAP)并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，藍白斑篩選，挑取陽性克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定插入片段大小正確后將菌液送華大基因生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果用BLAST進行同源性分析。

1.3 杜氏鹽藻FAP cDNA的3’端擴增 根據(jù)得到的已知序列用Primer Premier 5.0設(shè)計3’RACE引物。外側(cè)引物:5’-GCTCATCTACATTCCTCTGC CCDC-3’，內(nèi)測引物:5’-CGTGAGCGACGCAGA CATCC-3’，產(chǎn)物大小 782 bp。提取杜氏鹽藻總RNA，按照First Choice RLM-RACE Kit說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為3’RACE模板。巢式PCR擴增FAP cDNA的3’端序列，PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠檢測，回收后與pMD19-T載體連接(pMD19-TFAP)并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α，陽性克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定后送華大基因生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果與RTPCR序列拼接。

1.4 秋水仙素處理后杜氏鹽藻FAP基因的表達情況分析 用Primer Premier 5.0在所得到的FAP cDNA片段中設(shè)計一對特異性引物，并同時設(shè)計GAPDH基因特異性引物如下。上游引物:5’-GCCAAC GAGTGCCAGTCAAA-3’，下游引物:5’-TGTTCAT GCCGTCCATCTCT-3’。GAPDH上游引物:5’-CAAGTTCTCCGCCCGATGTGA-3’，GAPDH下游引物:5’-GAACACGCCTGTGCCCTCAA-3’。接種杜氏鹽藻培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集鹽藻細胞重懸于相同的UTEX培養(yǎng)基中并平均分成實驗組和對照組，實驗組加入秋水仙堿至終濃度為0.189 μmol/ L，對照組不作處理。分別在處理后0、30、60、90、120及150 min取樣離心，收集沉淀后加Trizol于－80℃冰箱中保存。將取得的樣品分別用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，用以上合成的引物進行PCR，以GAPDH作為內(nèi)參。PCR體系:cDNA 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTP 4 μL，LA Buffer 5 μL，LA Taq 0.25 μL，H2O 39.75 μL，共50 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃4 min;94℃30 s，60℃ 30 s，72℃30 s，30個循環(huán);72℃10 min，4℃終止。PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)處理，秋水仙堿處理后，2組FAP mRNA表達水平的比較采用2×6析因設(shè)計的方差分析，檢驗水準 α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 杜氏鹽藻FAP cDNA片段分析結(jié)果

2.1.1 杜氏鹽藻總RNA質(zhì)量鑒定 瓊脂糖凝膠電泳顯示28S和18S亮度比例約為2∶1，無拖尾現(xiàn)象，所提RNA完整性較好，A(260 nm)/A(280 nm)介于1.8～2.0，無DNA和蛋白質(zhì)污染，可用于下一步實驗。

2.1.2 FAP cDNA片段擴增產(chǎn)物鑒定結(jié)果 電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物片段長度約1 500 bp，與推測值1 535 bp相符。膠回收后連接于pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化篩選后雙酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

2.1.3 3’RACE產(chǎn)物鑒定結(jié)果 3’RACE產(chǎn)物電泳后得到一條大于800 bp左右的條帶，膠回收后與pMD19-T載體連接，質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，結(jié)果見圖2。

2.1.4 FAP cDNA序列分析結(jié)果 拼接后所得到的FAP cDNA片段總長2 141 bp，其中開放閱讀框1 626 bp，編碼541個氨基酸，3’非翻譯區(qū)515 bp。所編碼的氨基酸序列經(jīng)比對與萊茵衣藻、團藻相應(yīng)序列的同源性分別為88%和89%。

2.2 秋水仙堿處理后杜氏鹽藻FAP基因的表達情況分析 RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖3。秋水仙素處理后杜氏鹽藻FAP基因表達量明顯高于對照組，見表1。

圖3 秋水仙堿處理后杜氏鹽藻FAP基因的表達

表1 秋水仙堿處理后FAP基因表達情況灰度分析

3 討論

所得到的杜氏鹽藻FAP的氨基酸序列與萊茵衣藻的FAP、團藻的CDC48都有較高的同源性，預(yù)測含有AAA結(jié)構(gòu)域，其中有ATP結(jié)合位點，能利用ATP水解提供的能量［3，10］，Walker A基序形成一個能結(jié)合核苷酸α和β磷酸基的環(huán)，Walker B基序包含4個脂肪族氨基酸和兩個帶負電荷的氨基酸，對Mg2+的結(jié)合至關(guān)重要，精氨酸指是AAA家族的特異基序，能感受ATP的結(jié)合將其水解并傳遞構(gòu)象改變。

CDC48能與Ufd1和NpL4形成復(fù)合體，該復(fù)合體將泛素化的待降解蛋白運輸?shù)?6S蛋白酶體［11］。對CDC48功能的研究主要側(cè)重于其在細胞有絲分裂起始控制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解以及植物細胞有絲分裂末期細胞壁形成中的作用，這些過程大多已證實與泛素化蛋白質(zhì)的降解相關(guān)［3-5］。研究發(fā)現(xiàn)，萊茵衣藻的鞭毛中存在游離的泛素和泛素化的蛋白質(zhì)，在鞭毛重吸收過程中，鞭毛中泛素化蛋白大量增加，并因此推測，在萊茵衣藻的鞭毛中存在一個泛素結(jié)合系統(tǒng)。而萊茵衣藻鞭毛蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果顯示FAP存在于衣藻的鞭毛中［2］。秋水仙堿能夠破壞紡錘體，并能引起杜氏鹽藻發(fā)生鞭毛重吸收［9］。作者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AP在秋水仙堿處理后的鹽藻細胞中表達量增加明顯，因此推測，F(xiàn)AP可能參與了鹽藻細胞鞭毛重吸收過程中細胞骨架蛋白及相關(guān)鞭毛組成蛋白的降解過程。然而，目前僅知道該蛋白在鞭毛中存在，是否在細胞的其他部位也有分布尚不清楚，對該蛋白在杜氏鹽藻細胞中進行定位非常必要。FAP是否參與了細胞骨架蛋白及鞭毛組成蛋白的降解尚需實驗證實，該蛋白的功能有待進一步研究。

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Cloning and expression of flagella associated protein cDNA fragment from Dunaliella salina and its expression during flagellar reabsorption

LI Liang，SHI Ke，LI Junping，CHAI Dandan，XUE LexunLaboratory for Cell Biology，Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

Dunaliella salina;flagella associated protein;colchicine

Aim:To clone flagella associated protein(FAP)cDNA fragment from Dunaliella salina and investigate its function.Methods:RT-PCR was carried out with degenerated primers designed according to the conserved amino acid sequences of Chlamydomonas reinhardtii，Volvox carteri f.nagariensis and other organisms.3’RACE was performed with specific primer designed based on the sequence obtained by RT-PCR.The transcription level of FAP gene of Dunaliella salina cells treated with colchicine was detected by RT-PCR using GAPDH as control.Results:A cDNA sequence of 1 535 bp and a 3’end sequence of 782 bp were obtained respectively，and an assembled sequence of the two sequences encoded a polypeptide predicted to be composed of 541 amino acids.The deduced amino acid sequence shared high homology with Chlamydomonas reinhardtii(88%)and Volvox carteri f.nagariensis(89%).Additionally，the expression of FAP mRNA in Dunaliella salina treated with colchicine was significantly higher than the untreated group(Fgroup=43.192，P＜0.001; Ftime=2.659，P=0.043;Finteraction=594.419，P＜0.001).Conclusion:The cDNA fragment of FAP from Dunaliella salina has been obtained successfully，and its expression increases during the flagellar reabsorption induced by colchicine.

Q781

*國家自然科學(xué)基金資助項目 30700014;科技部國際科技合作基金資助項目 2007DFA01240

(2011-03-30收稿 責(zé)任編輯王 曼)