人工養(yǎng)殖鱘魚魚頭蛋白粉的制備工藝

段濤，田素娟，程波，張玉容，藍澤橋

（1.廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006；2.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430074；3.湖北天峽鱘業(yè)有限公司，湖北 宜都 443300）

人工養(yǎng)殖鱘魚魚頭蛋白粉的制備工藝

段濤1，田素娟1，程波2，張玉容2，藍澤橋3

（1.廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006；2.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430074；3.湖北天峽鱘業(yè)有限公司，湖北 宜都 443300）

對比研究3種蛋白酶水解鱘魚魚頭的效果，單酶水解選擇胃蛋白酶為水解的最適酶種，雙酶水解采用正交試驗確定其最佳的復合酶種為胃蛋白酶加木瓜蛋白酶,水解條件為溫度37℃和50℃、酶用量50 μkat/g、分別在最適pH2.5與pH6.5下共水解5 h、料液比1∶2（g/mL），蛋白質回收率可達到93.52%；經(jīng)過酸浸預處理后水解液基本無腥苦味，經(jīng)真空冷凍干燥可制得蛋白含量為78.12%的蛋白粉。

鱘魚；魚頭；蛋白粉；酶法；最佳工藝條件

進入21世紀，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，水產(chǎn)品年產(chǎn)量約達4896萬t（2008），人均37.0 kg，已居世界首位[1]。自20世紀90年代鱘魚養(yǎng)殖業(yè)起步以來，到目前，鱘魚養(yǎng)殖遍及全國20多個省市自治區(qū)，年養(yǎng)殖產(chǎn)量8000 t，產(chǎn)值達3億元，已形成產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖[2]。鱘魚頭部約占魚體的6%～8%，鱘魚頭大且包括硬骨和軟骨，而目前主要以原始產(chǎn)品的形式進入市場，附加值較低[3]，對鱘魚頭的開發(fā)研究也基本空白。鱘魚頭中含有大量魚皮、硬骨和軟骨，蛋白質含量較高[4]，利用鱘魚加工后廢棄的頭料，采用多種工藝，將鱘魚頭制成蛋白粉，可作為優(yōu)良飼料添加劑的或蛋白質營養(yǎng)劑，既為開發(fā)一種新的蛋白飼料來源也為開發(fā)鱘魚的深加工產(chǎn)品提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

施氏鱘魚頭于2010年3月20日天峽鱘業(yè)有限公司提供，取自體長1.1 m～1.5 m，體重45 kg～55 kg的成體施氏鱘魚，共取3尾，洗凈烘干粉碎備用。

1.2 儀器

索氏提取器；SKD-200微量凱氏定氮儀：上海沛歐；SX2-4-10馬福爐:上海滬粵明；坩堝；AL204電子天平：梅特勒-托利多；LD4-2A型低速離心機:北京京立；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱、DD-522電熱恒溫水浴鍋:上海精宏；Eppendorf centrifuge冷凍微量離心機5417R型；FD－1冷凍干燥機：北京博醫(yī)康技術公司；D25-2F型電動攪拌器:上海群尚。

1.3 方法

1.3.1 單酶法和雙酶法制備工藝

1.3.1.1 原料預處理

取一定量原料經(jīng)超聲提取脫脂處理后，并置通風櫥中除去剩余乙醚，每50克脫脂魚頭粉加醋酸或檸檬酸浸泡4 h。

1.3.1.2 鱘魚魚頭的酶解

處理好的魚頭粉，加酶在最適溫度和最適pH下進行酶解并用機械攪拌器不斷攪拌。酶解完成后迅速升溫水解液到100℃并保持10 min，使其在滅酶的同時起到一定的殺菌效果，料液離心過濾后得魚蛋白水解液，最后減壓抽濾濃縮，再冷凍干燥得到蛋白粉成品。

1.3.2 單酶法的工藝條件研究

1.3.2.1 不同酶的最適水解溫度的選擇

胰蛋白酶選取45、50、55℃；木瓜蛋白酶選取45、50、55℃；胃蛋白酶選取30、37、45℃；魚頭加入酶量為50 μKat/g，分別在3種溫度下水解。

1.3.2.2 不同酶的最適酶量的選擇

選胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，每種酶分別取酶量17、50、83 μkat/g，在各自最適溫度50、50、37 ℃水解。進行酶量對水解效果影響的單因素試驗。

1.3.2.3 酶解時間對酶解效果的影響

分別選取胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，在各自最適溫度和最適pH下進行水解4 h,每隔1 h取樣檢測水解效果。

1.3.3 雙酶法的工藝條件研究

選取胃蛋白酶和木瓜蛋白酶（復合酶A），木瓜蛋白酶和胰蛋白酶（復合酶B），胰蛋白酶和胃蛋白酶（復合酶C）進行雙酶法工藝研究，以復合酶的類型（A）、酶量（B）（組合酶中2種酶量取相等）、原料的料液比（C）、酶解時間（D）為試驗因子，以蛋白質回收率和DH為指標，采用L9（34）正交試驗設計，對雙酶法酶解鱘魚頭制蛋白粉的水解條件進行優(yōu)化，得到雙酶水解的最佳工藝條件，見表1。

表 1 試驗方案Table 1 Experiment design

1.4 檢測方法

1.4.1 蛋白質含量測定

依據(jù)GB/T5009.6-2003[5]《食品中蛋白質的測定方法》，凱氏定氮法測定。

1.4.2 蛋白質回收率

1.4.3 水解度

水解完成后取10 mL濾液加10 mL三氯乙酸（預先配成20%的濃度），攪拌后經(jīng)10000 r/min，離心10 min，用凱氏定氮法測定上清液和濾液中蛋白質含量。水解度按下列公式計算[6]：

水解度/%=（上清液中蛋白質含量/濾液中蛋白質總量）×100

1.4.4 感官標準評分

將過濾后酶解液煮沸，由評定小組10位鑒定人員品嘗。環(huán)境溫度為25℃，濕度適中。鑒評程序嚴格按照要求進行，采用評分檢驗法，將鑒定成員的打分結果進行匯總、平均，即得出各個樣品的鑒評分數(shù)，見表2。

表 2 感官標準評分表[7]Table 2 Sense organs standard grade point form

2 結果

2.1 單酶法的工藝條件研究

以下單因素試驗的基礎條件，見表3。

表 3 試驗基本條件Table 3 Experiment conditions

2.2 溫度對酶解效果的影響

根據(jù)不同蛋白酶的最適溫度范圍選擇3種溫度進行了考察，通常溫度較低時,溫度升高加速水解反應過程處主要地位；當溫度較高時，酶失活過程處主導地位，使水解速度加快的同時，酶失活更快，產(chǎn)物生成濃度在反應結束時反而下降[8]，見圖1。

由圖1可以看出胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的氨基酸含量峰值分別50、50、37℃，因此選擇最適水解溫度分別為50、50、37℃。

2.3 酶量對酶解效果的影響

酶量對酶解效果的影響，見圖2、圖3。

由圖2、圖3可知，隨著酶用量的增加，蛋白質回收率和水解度變化的趨勢是逐漸增加的。添加不同酶用量的酶解效果見表4?？梢钥闯?，在水解初期，前述兩指標上升很快，但當酶用量增大到一定程度時，對于一定量的底物和一定水解時間，蛋白質的回收率和水解度逐漸趨緩，同時酶量加大，成本提高，苦味也會加重。綜合考慮以上因素，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶加酶量分別以50 μkat/g為宜。

表 4 3種蛋白酶不同酶量酶解效果的比較Table 4 Hydrolysis effects of different protase concentration

2.4 酶解時間對酶解效果的影響

酶解時間對酶解效果的影響，見表5、圖4。

表 5 3種蛋白酶不同酶解時間酶解效果的比較Table 5 Hydrolysis effects of different protase concentration

由表5可知隨水解時間延長，蛋白質回收率不斷增加，但到一定時間后趨緩，而由圖4可顯示水解度是呈直線上升的，因此水解時間以4 h以上較佳。

2.5 雙酶法的工藝條件研究

由于單酶水解蛋白的作用位點較單一，考慮用前述幾種酶組合成雙酶酶解，選取復合酶的類型（A），酶量（B），原料的料液比（C），酶解時間（D）四因素進行正交試驗，研究雙酶水解工藝，結果見表 6。

表 6 正交試驗結果分析Table 6 Result anlysis of orthogonal experiment

由極差分析可知，各因素對蛋白質回收率影響程度依次為：酶種≈酶量>>料液比≈時間。確定胃蛋白酶加木瓜蛋白酶雙酶水解鱘魚魚頭最佳條件為:加酶量50 μkat/g，料液比1∶2（g/mL），酶解時間5 h，酶解溫度先50℃再降為37℃，pH為先6.5加木瓜蛋白酶反應2.5 h，再加醋酸或檸檬酸調至2.5加胃蛋白酶反應2.5 h。在此條件下測得蛋白質回收率為93.52%，水解度為40.36%，感官指標為2。

2.6 水解液脫腥苦

經(jīng)超聲脫脂處理的干燥魚頭粉，脂肪含量很低，不易變質產(chǎn)生異味。在此基礎上處理時，魚頭粉采用醋酸或檸檬酸浸泡過，發(fā)現(xiàn)這樣處理后的魚頭酶解后基本無腥味，控制水解度超過40%后基本無苦味，特別是檸檬酸浸泡的魚頭酶解口感好，還有淡淡香味?？紤]經(jīng)濟因素，如果作為食品級可用檸檬酸作前處理，飼料級可用醋酸進行前處理。

2.7 魚蛋白粉的制備

前述制得的魚蛋白水解液經(jīng)真空冷凍干燥，得到白色或淡黃色粉末狀成品，且無不良氣味，經(jīng)測定其中蛋白質含量為78.12%，水分含量為0.80%，脂肪含量為1.50%，灰分為20.83%。

3 結論與討論

3.1 單酶法水解鱘魚魚頭制蛋白粉工藝

得到了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶水解鱘魚魚頭制蛋白粉的最適溫度分別為，50、50、37℃；加酶量量分別以50 μkat/g為宜；水解時間以4 h以上較佳。其中胃蛋白酶水解效果最佳，水解時間5 h，蛋白質回收率為91.44%，水解度為38.53%，感官指標為3。胰蛋白酶水解效果較差，可能由于其酶切位點較專一的緣故。

3.2 雙酶法水解鱘魚魚頭制蛋白粉工藝

在單酶法水解蛋白粉的研究基礎上，為進一步提高蛋白水解液的質量，采用正交實驗確定了雙酶水解的最佳工藝：最佳的復合酶種為胃蛋白酶加木瓜蛋白酶,水解條件為溫度37℃和50℃、酶用量50 μkat/g、分別在最適pH2.5與pH6.5下共水解5 h、料液比1∶2（g/mL），蛋白質回收率可達到93.52%；經(jīng)過酸浸預處理后水解液基本無腥苦味，經(jīng)真空冷凍干燥可制得蛋白含量為78.12%的蛋白粉。

3.3 酶法水解鱘魚魚頭制蛋白粉工藝的探討

通過對酶解工藝的研究，可見最佳組合酶種是胃蛋白酶加木瓜蛋白酶，研究表明酶作用位點和親和力之間有一定的對應一致關系，作用位點氨基酸含量最多的蛋白酶，其親和力也最大，反之依然[9]。由于胃蛋白酶作用位點是Phe、Trp、Tyr、Leu、Ile、Met，等；木瓜蛋白酶作用位點是Asp、Trp、Tyr，而胰蛋白酶是酶切位點較專一;且鱘魚魚頭中皮和軟骨含量大，因此Phe、Trp、Leu、Asp等含量較高[10]，因此胃蛋白酶加木瓜蛋白酶組合酶切位點最多,親和性最好,酶解效果好,并且可以與前處理結合,考慮到經(jīng)濟因素，采用胃蛋白酶加木瓜蛋白酶工藝較好。所得鱘魚頭蛋白粉為白色或淡黃色，基本無異味，與肉類水解所得產(chǎn)品相似，產(chǎn)品可作為優(yōu)良的飼料添加劑或蛋白質營養(yǎng)劑，應用前景較廣[11]，可為鱘魚廢棄物的綜合利用提供新思路。

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Study on Preparation Technology of Protein Powder from Fish Head in Acipenseridae Sturgeon

DUAN Tao1，TIAN Su-juan1，CHENG Bo2，ZHANG Yu－rong2，LAN Ze－qiao3
（1.School of Life Sciences＆ Biopharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.School of Chemical Engineering ＆ Pharmacy，WU HAN Istitute of Technology，Wuhan 430074，Hubei，China；3.HuBei Tianxia Sturgeon Company，Yidu 443300，Hubei，China）

The hydrolysis of the skin in Acipenseridae sturgeon by three kinds of enzymes was studied.Pepsin was chose as the best enzyme in the single enzyme method.The optimal processing conditions were obtained by orthogonal experiments in the bi－enzyme method.The parameters are as follows：protease complex from both Pepsin and papain have much higer hydrolysis efficiency，the reaction temperature is 37℃ and 50℃，the added enzyme dosage is 50 μkat/g，the pH value is 6.5 and 2.5，the solid－liquid ratio is 1∶2 and reaction time is 5 h，the recovery of the protein was 93.52%.Hydrolysate has little fish－odor when treated with pretreatment of acid.Hydrolysate could be dried into fish protein powder by freeze drying technology.The purity of fish protein powder is 78.12%.

Acipenser schrenckii；fish head；protein powder；enzyme hydrolysis；optimal processing conditions

段濤（1977—），女（漢）,講師，碩士，主要從事生物制藥，天然活性產(chǎn)物的分離純化及性質鑒定等研究工作。

2011-07-01