薄層色譜法測(cè)定蜂蜜中高果糖淀粉糖漿

張穎璐，劉明剛，李琳

（天津市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站第六十九站，天津 301609）

如今蜂蜜市場(chǎng)中出現(xiàn)了許多摻假現(xiàn)象，這些人利用高果糖淀粉糖漿具有顏色和味道與蜂蜜極為相似，但價(jià)值比蜂蜜便宜很多的特點(diǎn)，向蜂蜜中摻入高果糖淀粉糖漿，為此，鑒別真假蜂蜜的技術(shù)也應(yīng)運(yùn)而生，主要有同位素質(zhì)譜法、薄層色譜法等，由于同位素質(zhì)譜法所采用的儀器設(shè)備較為昂貴，所以薄層色譜法被廣泛使用[1]。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

無水乙醇（分析純）；正丁醇（分析純）；冰乙酸（分析純）；丙酮（分析純）；磷酸（優(yōu)級(jí)純）；85%磷酸；活性炭：DarcoG-60或相當(dāng)者，100目；硅藻土：Celite545助濾劑或相當(dāng)者；二苯胺鹽酸鹽（C.A.S.：537－67－7）；苯胺:重蒸餾。

乙醇溶液（7＋93）：移取35 mL無水乙醇至500 mL試劑瓶中，加人465 mL水混勻。

乙醇溶液（1＋3）：移取125 mL無水乙醇至500 mL試劑瓶中，加人375 mL水混勻。

乙醇溶液（1＋1）：移取250 mL無水乙醇至500 mL試劑瓶中，加人250 mL水混勻。

薄層展開劑：正丁醇＋冰乙酸＋水（2＋1＋1）。

顯色劑：稱取1.0 g二苯胺鹽酸鹽（3.9）至盛有50.0 mL丙酮（4.4）的燒杯中，再加入1 mL苯胺（3.10），混合攪拌，同時(shí)加人5 mL 85%的磷酸（3.6），此時(shí)會(huì)有白色絮狀出現(xiàn)，完全溶解后可使用。此顯色劑要臨用時(shí)現(xiàn)配，各種試劑要按以上順序添加。

薄層層析板:硅膠G板200 mm×200 mm或100 mm×200 mm（根據(jù)實(shí)際做樣品數(shù)選擇合適規(guī)格的硅膠G板），膜厚0.25 mm，使用前應(yīng)畫板，畫板方法為下端留2 cm，左邊和右邊各留2 cm，從下端2 cm處向上量3.5 cm位置畫線，此線為Rf值，從下端2cm處向上量10cm位置畫線，此線為爬板終點(diǎn)線，爬過此線視為爬板結(jié)束，畫好板后要在110℃恒溫干燥箱中活化1 h后，置于干燥器中放冷至室溫，備用。

水：本實(shí)驗(yàn)中所用水均為經(jīng)濾膜抽濾過的蒸餾水。

1.2 儀器和設(shè)備

HW.B-2恒溫干燥箱：天津東方實(shí)驗(yàn)廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；玻璃噴霧器:薄層色譜用；SHZ－D（Ⅲ）真空抽氣泵（可調(diào)真空度0～100 kPa）：北京萊伯泰科儀器有限公司；薄層色譜展開槽；微量注射器（10 μL）；AEG220G分析天平（感量:0.0001 g）：日本島津公司；電吹風(fēng)機(jī)；層析柱：帶旋塞的玻璃管，內(nèi)徑20 mm～22 mm，長300 mm～400mm。

1.3 方法

試樣中的高分子糖，經(jīng)活性炭—硅藻土柱的富集、濃縮，再用薄層色譜法分離、檢測(cè)，經(jīng)與摻有一定含量的高果糖淀粉糖漿的純蜂蜜比較，來判定蜂蜜中高果糖淀粉糖漿的存在。

1.3.1 活性炭柱-硅藻土柱的裝填與保存

用玻璃棉將脫脂棉包成小包塞在柱子底部，關(guān)掉活栓后加水到玻璃管的中部，放水除去玻璃棉中的氣泡至水量約10 mL時(shí)關(guān)掉活栓。在小燒杯中稱取2.0 g的硅藻土（1.1.8），加入少量的水?dāng)嚢枳⑷牍苤?，自然沉降后在玻璃棉的上方堆積成約1 cm厚的硅藻土層。稱取活性炭（1.1.7）和硅藻土混合物（1＋1）12 g，加入50 mL的水?dāng)嚢杈鶆蜃⑷斯苤校ㄓ捎诠柙逋梁突钚蕴勘戎夭煌?，必須攪拌均勻后方可注入管中，否則會(huì)影響柱效）。打開活栓，在真空抽氣泵的吸引下使混合物沉降堆積，用水將粘在管壁的混合物沖洗干凈，整個(gè)過程需要用150 mL水來過柱，水面到達(dá)柱面1 cm時(shí)關(guān)掉活栓。再次注入用水混合后的2.0 g硅藻土，讓其自然沉降后，在真空抽氣泵吸引下，用500 mL水預(yù)洗活性炭柱，通過調(diào)節(jié)真空抽氣泵的真空度控制流速在8.5 mL/min左右。液面到達(dá)柱上1 cm時(shí)關(guān)掉活栓，備用。注意：以上操作過程中均不能將柱子抽干。

應(yīng)在使用前填裝，如暫時(shí)不用，可用乙醇溶液（1＋1）150 mL浸泡，用保鮮膜和生料帶封口，此法可保存3個(gè)月，用前再用500 mL水預(yù)洗。若用水封，則可保存1個(gè)月。

1.3.2 試樣制備與保存

對(duì)無結(jié)晶的實(shí)驗(yàn)室樣品，將其攪拌均勻。對(duì)有結(jié)晶的樣品，在密閉情況下，置于不超過60℃的水浴中溫?zé)?，振蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫。分出0.5 kg作為試樣。制備好的試樣置于樣品瓶中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記。將試樣于常溫下保存。

1.3.3 分析步驟

1.3.3.1 樣品前處理

1）過柱

在50 mL燒杯中稱取1 g（精確到1 mg，且小數(shù)點(diǎn)后第4位應(yīng)小于5）試樣。溶于10 mL水后，緩慢加到活性炭－硅藻土柱上，打開活栓，在真空抽氣泵吸引下，使試料溶液通過柱子。分2次各用5mL水沖洗燒杯后，沖洗液也加人柱中，液面下降到柱面上端時(shí)應(yīng)關(guān)閉活栓，停止吸引，不要抽干液體。量取乙醇溶液（7＋93）300 mL（每次100 mL，分3次）加到活性炭柱中，真空抽吸控制流速在8 mL/min左右，棄掉流出液。然后再加人乙醇溶液（1+3）100 mL，在同樣條件下洗脫，洗脫液全部棄掉，并將液體抽干，觀察活栓下不再有液體滴下，視為已抽干。然后將接收瓶換成在干燥器中干燥過的具塞錐形瓶，再加入乙醇溶液（1+1）100 mL，在同樣條件下洗脫，將洗脫液全部收集，并要收集完全，觀察不再有液體滴入錐形瓶為止。

2）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)

用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在80℃水浴中蒸干，開始溫度不要過高，設(shè)置在65℃左右為佳，溫度慢慢升高，這個(gè)過程要注意不要使錐形瓶中的液體沸騰而丟失，否則會(huì)造成樣品丟失。將錐形瓶中的液體蒸干后，向瓶中加入1 mL水，用玻璃棒把粘在瓶底及瓶身的混合物洗下來，然后過水系濾頭，轉(zhuǎn)移至2 mL小管中，作為薄層層析用點(diǎn)樣液。

1.3.3.2 對(duì)照樣品的制備與保存

分別稱取1 g蜂蜜，1 g蜂蜜并加入0.0650 g糖漿、1 g蜂蜜并加入0.1300 g糖漿（注：1 g蜂蜜精確到1 mg，且小數(shù)點(diǎn)后第4位應(yīng)小于5）。后按1.3.3.1操作，制備對(duì)照樣品純蜂蜜，含有5%、10%糖漿蜂蜜。標(biāo)準(zhǔn)液可以一次制備冷凍保存，長期使用。

1.3.3.3 薄層層析

1）點(diǎn)板

用10 μL微量注射器在距離薄層板下端2 cm的位置，點(diǎn)上6.0 μL的樣液，同時(shí)水平間隔2 cm，點(diǎn)上同樣量經(jīng)過同樣處理的純蜂蜜和含有5%、10%糖漿的蜂蜜的標(biāo)準(zhǔn)液作為對(duì)照。點(diǎn)樣時(shí)點(diǎn)越小，越集中爬板效果就越好，點(diǎn)一下就要迅速用吹風(fēng)機(jī)吹干。

2）爬板

點(diǎn)樣結(jié)束后把薄層板放入展開槽中（薄層展開前，展開槽用展開劑蒸氣預(yù)飽和過夜，用一張濾紙將展開槽四壁圍好，并將展開槽密封），按傾斜上行法展開，為加快爬板速度可將展開槽放在溫度較高的室內(nèi)，以加快分子反應(yīng)速度。當(dāng)展開劑前沿爬過薄層板終點(diǎn)線時(shí)即可。

3）顯色

從展開槽中取出薄層板，用吹風(fēng)機(jī)把展開劑完全吹散后，把顯色劑（1.1.15）均勻噴霧在薄層板上，等顯色劑完全蒸發(fā)后，放入110℃的恒溫干燥箱中烘7 min～10 min使之顯色。

1.3.3.4 結(jié)果判定

從恒溫干燥箱中取出薄層板，觀察顯色情況，純蜂蜜只在Rf值0.35以上的區(qū)域有2個(gè)～3個(gè)藍(lán)色中帶灰色或咖啡色的斑點(diǎn)，相比較糖漿或混有糖漿的蜂蜜卻是從原點(diǎn)開始呈現(xiàn)藍(lán)色帶狀樣的斑點(diǎn)群?；煊刑菨{5%的蜂蜜，如果點(diǎn)樣6 μL，可出現(xiàn)混有糖漿蜂蜜一樣的特點(diǎn)。因此，假如從原點(diǎn)開始到Rf值0.35附近有藍(lán)色帶狀斑點(diǎn)群出現(xiàn)，應(yīng)考慮混有由淀粉轉(zhuǎn)化來的高果糖淀粉糖漿，此時(shí)判定陽性。檢出限為5%。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果表述

用陰性和陽性表示。

出現(xiàn)斑點(diǎn)群位置在Rf值0.35以下，斑點(diǎn)顏色和含有5%糖漿相比較要深一些的判定為陽性（+），表示摻有高果糖淀粉糖漿。

出現(xiàn)斑點(diǎn)群位置在Rf值0.35以上或出現(xiàn)斑點(diǎn)群位置在Rf值0.35以下但斑點(diǎn)顏色和含有5%糖漿相比較要淺一些的判定結(jié)果為陰性（-），表示沒有高果糖淀粉糖漿。

2.2 方法的適用性

為了驗(yàn)證該方法的適用性，選擇了油菜、洋槐、紫云英、荊條、棗花、椴樹、葵花、蕎麥等8種蜂蜜樣品，這些樣品來源可靠，并已經(jīng)碳同位素法確認(rèn)是純正蜂蜜，對(duì)這些樣品進(jìn)行了空白及添加5%、10%高果糖淀粉糖漿的實(shí)驗(yàn)，薄層色譜圖見圖1[2-7]，結(jié)果如表1。

表1 8種蜂蜜添加5%、10%高果糖淀粉糖漿檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 The test results of 8 kinds of honey and added 5%，10%high fouctose stearch sgrup

從圖1、表1可以看出，本法適用于上述8種蜂蜜的鑒別，因此可選擇來源可靠，并已經(jīng)碳同位素法確認(rèn)的純正蜂蜜作為標(biāo)準(zhǔn)純蜂蜜，同時(shí)在純蜂蜜中分別添加5%和10%高果糖淀粉糖漿作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。

圖2是11個(gè)批次蜂蜜，用薄層色譜法測(cè)定高果糖淀粉糖漿的譜圖。

由圖2可以看出，出現(xiàn)斑點(diǎn)群位置在Rf值0.35以下，斑點(diǎn)顏色和含有5%糖漿相比較要深一些的樣品判定為陽性（+），表示摻有高果糖淀粉糖漿。其他情況均判定為陰性（-）。由此可以判定，9#、10#、11#、12#、13#、28#、26#為陽性，含有高果糖淀粉糖漿。

3 結(jié)論

根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)和比較，使用薄層色譜法可以有效地檢測(cè)出蜂蜜中高果糖淀粉糖漿的含量，從而鑒定蜂蜜的真?zhèn)危行ПＷo(hù)消費(fèi)者的利益。

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[4]龐國芳，范春林，曹彥忠，等.穩(wěn)定碳同位素技術(shù)測(cè)定蜂蜜中碳-4植物糖的方法研究[J].中國養(yǎng)蜂，2003，54：5-9

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