青蒿琥酯抗大鼠免疫性肝纖維化的作用及機制研究

來麗娜，楊柳絮，郭春花，張曉一，王黎敏，范毅敏

肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段?，F(xiàn)普遍認為肝纖維化屬可逆性病變，但目前仍沒有療效確切且不良反應少的抗肝纖維化藥物。我國中藥資源豐富，從天然藥物中發(fā)掘抗肝纖維化的藥物具有廣闊的前景。

青蒿素是從黃花蒿中提取的一種含內(nèi)過氧化基團的倍半萜內(nèi)酯化合物。青蒿素及其衍生物具有抗瘧、免疫抑制、抗病毒及抗腫瘤等多方面藥理作用，且不良反應較少［1］。青蒿琥酯(artesunate，Art)為青蒿素水溶性的衍生物。我們前期研究發(fā)現(xiàn)［2］，青蒿琥酯對CCl4混合因素所致的大鼠肝纖維化有防治作用，本實驗制備免疫性大鼠肝纖維化模型，進一步探討青蒿琥酯的抗肝纖維化作用及其可能機制，為其開發(fā)成抗肝纖維化藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與HSC-T6細胞株 Wistar大鼠，♀♂各半，清潔級，體質(zhì)量175 ～200 g，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心。HSC-T6細胞株由長治醫(yī)學院肝病研究所趙中夫教授惠贈。

1.1.2 實驗藥品和試劑 青蒿琥酯，廣西桂林制藥二廠;秋水仙堿(colchicine，Col)，昆明股份制藥有限公司，批號070509;不完全弗氏佐劑，Sigma公司產(chǎn)品;牛血清白蛋白(Albumin Bovine，BSA)，Amresco公司產(chǎn)品分裝;羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)，上海潤成生物科技有限公司，分析純，批號20090322。TGF-β1(Sigma公司)，RNAiso Plus抽提試劑(TaKa-Ra公司)，DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)，RNA PCR Kit(AMV)Ver3.0(TaKaRa公司)，Western細胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)，HRP標記的anti-Mouse IgG(Promega公司)，小鼠來源GAPDH一抗(碧云天生物技術(shù)研究所)，小鼠來源collagenⅠ一抗(Abcam公司)，PCR引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及分組 將弗氏不完全佐劑與同體積的18 g·L-1BSA生理鹽水溶液混合并順時針研磨制成9 g·L-1BSA弗氏不完全佐劑乳劑。除正常組外。每只大鼠每次0.5 ml足墊注射，共5次。第1、2次間隔2周，其余間隔1周。末次致敏注射后1周，球后靜脈叢采血測抗BSA抗體。取抗體陽性者尾靜脈攻擊注射5 g·L-1BSA生理鹽水溶液(0.1 ml·kg-1)，每周2次，共10次。大鼠隨機分為正常對照組、模型組、大、中、小劑量 Art組(5、15、45 mg·kg-1)、Col組(0.1 mg·kg-1)。治療組自尾靜脈攻擊注射BSA生理鹽水開始灌胃給藥，模型組和正常對照組灌胃同劑量蒸餾水，每日1次，直至實驗結(jié)束。實驗結(jié)束后，股動脈放血制備血清，-20℃冰箱保存。同時留取肝臟組織用于各項檢測。

1.2.2 肝組織病理學觀察 取肝左葉相同部位，10%甲醛溶液固定，石蠟切片，Masson染色，光鏡下觀察膠原纖維增生情況。

1.2.3 肝組織Hyp的測定 肝組織脫脂，研磨烘干，衡重后取組織粉末40 mg裝入定做的安瓿中，加入6 mol·L-1HCl 6 ml乙醇噴燈封口，105℃烤24 h，冷卻后敲開安瓿，取50 μl放入試管中烘干待測，參照 Jamall的方法［3］。

1.2.4 RT-PCR 檢測肝組織 α-SMA、TGF-β1mRNA的表達 RNAiso Plus提取肝組織總RNA，定量。以總RNA 1 μg為模板，用oligo(dT)作為引物。TGF-β1(547 bp)［4］:上游 5′-GCG GTG CTC GCT TTG T-3′，下游 5′-GGA AGG GTC GGT TCA T-3′;α-SMA(542 bp):上游 5′-CTG TCC CTC TAT GCC TGT GG-3′，下游 5′-AGG GCT GTG ATC TCC TTC TG-3′;βactin(300 bp):上游 5′-AGC TGA GAG GGA AAT CGT GCG-3′;下游 5′-GTG CCA CCA GAC AGC ACT GTG-3′。PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)測定條帶的灰度值，以目的條帶與β-actin條帶灰度值之比作為半定量標準。

1.2.5 HSC-T6細胞的培養(yǎng)和分組 采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。實驗分為對照組，TGF-β1刺激組(5 μg·L-1)，聯(lián)合處理組(Art終濃度［5］6.25、25、50 mg·L-1+5 μg·L-1TGF-β1)。細胞生長至 80%以上融合度時，全部換含無血清的DMEM培養(yǎng)液同步化處理12 h后吸棄培養(yǎng)液。TGF-β1組換含5 μg·L-1TGF-β1的培養(yǎng)液，聯(lián)合處理組用 5 μg·L-1TGF-β1預處理 30 min 后［6］再加入不同濃度的 Art作用24 h。

1.2.6 RT-PCR檢測HSC-T6細胞 ProcollagenⅠmRNA 的表達 ProcollagenⅠ(698bp)［7］:上游 5′-CCT GGC AAG AAC GGA GAT GAT-3′;下游 5′-ACC GAC AGC ACC ATC GTT ACC-3′。

1.2.7 Western blot檢測HSC-T6細胞collagenⅠ蛋白的表達 裂解液裂解細胞，蛋白定量。取總蛋白50 μg，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉后分別加入一抗，4℃過夜，洗膜后再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗雜交，加入ECL發(fā)光液。X線底片曝光。以目的條帶與內(nèi)參照GAPDH條帶灰度值的比值代表蛋白的表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.5軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析，多組間比較用SNK法。

2 結(jié)果

2.1 Art對大鼠肝組織病理變化的影響 正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細胞呈索狀分布，板間有不規(guī)則肝竇，匯管區(qū)無擴大。模型組正常小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝細胞索排列紊亂，膠原纖維構(gòu)成的纖維間隔破壞界板，分割包繞肝小葉，有半數(shù)以上有假小葉形成。Art組大部分肝小葉結(jié)構(gòu)接近正常，僅匯管區(qū)有少量纖維增生，肝索排列趨于整齊，少許尚留有較細的纖維條索但無小葉包繞。Col組肝細胞索排列紊亂，膠原纖維增生程度較模型組輕，有纖維條索分割包繞小葉，但未見明顯的假小葉的形成，見Fig 1。

Fig 1 Effect of Art on the histological morphology of immunological hepatic fibrosis rat liver by Masson staining(×75)A:Normol group;B:Model group;C:Art treated group(5 mg·kg-1);D:Art treated group(15 mg·kg-1);E:Art treated group(45 mg·kg-1);F:Col treated group(0.1 mg·kg-1).

2.2 Art對大鼠肝組織Hyp的影響 與正常組比較，模型組大鼠肝臟Hyp含量明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較，Art各劑量組大鼠肝組織中Hyp的含量明顯降低(P＜0.01)，與Col組比較差異無顯著性，見Tab 1。

Tab 1 Effect of Art on content of hyproxyproline in immunological hepatic fibrosis rat liver( ± s，n=10)

Tab 1 Effect of Art on content of hyproxyproline in immunological hepatic fibrosis rat liver( ± s，n=10)

△P＜0.05，△△P ＜0.01 vs normal group;＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Dose/mg·kg-1 Hyp/mg·g-1liver Normol 0.511±0.184 Model 2.556±0.588△△Art 5 0.946±0.257＊＊15 0.725±0.297＊＊45 0.816±0.282＊＊Col 0.1 1.229±0.306△＊＊

2.3 Art對大鼠肝組織 α-SMA、TGF-β1mRNA 表達的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，模型組α-SMA and TGF-β1mRNA表達明顯高于正常組(P＜0.01);Art 15、45 mg·kg-1治療組 α-SMA mRNA表達明顯低于模型組(P＜0.01)，Art 5 mg·kg-1組和Col組與模型組比較，α-SMA mRNA表達也降低(P＜0.05)，Art 15、45 mg·kg-1治療組和 Col組 TGF-β1mRNA表達明顯低于模型組(P＜0.01)，Art 5 mg·kg-1組與模型組比較，TGF-β1mRNA表達也降低(P＜0.05)，見 Fig 2。

Fig 2 Effect of Art on expression of α-SMA and TGF-β1 mRNA in immunological hepatic fibrosis rat liverˉ±s，n=6)A:Expression of α-SMA mRNA was detected by RT-PCR;B:Expression of TGF-β1mRNA was detected by RT-PCR;C:The densitometric analysis for relative changes in the indicated groups.M:DNA marker;1:normol group;2:Model group;3:Art treated group(5 mg·kg-1);4:Art treated group(15 mg·kg-1);5:Art treated group(45 mg·kg-1);6:Col treated group(0.1 mg·kg-1).△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs normal group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group

2.4 Art對 HSC-T6ProcollagenⅠmRNA 和 collagenⅠ蛋白表達的影響 從Fig 3中可以看到，TGF-β1組ProcollagenⅠmRNA和collagenⅠ蛋白表達明顯高于對照組(P＜0.01)，與 Art共培養(yǎng)后，Art 6.25、25、50 mg·L-1ProcollagenⅠmRNA 和 collagenⅠ蛋白的表達明顯降低(P＜0.01)，Art 50 mg·L-1尤為明顯。

Fig 3 Effect of Art on expression of procollagenⅠmRNA and collagenⅠproteins in HSC-T6 cells(±s，n=6)A:Expression of procollagenⅠmRNA was detected by RT-PCR assay;B:Expression of collagenⅠprotein was detected by Western blot assay;C:The densitometric analysis for relative changes in the indicated groups.M:DNA marker;1:Control group;2:TGF-β1group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs TGF-β1group.

3 討論

有報道青蒿素類化合物能治療結(jié)締組織增生性疾病，對CCl4引起的小鼠肝損傷有保護作用，以青蒿鱉甲湯為主方配合辨證用藥，能明顯降低乙型肝炎患者血清透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原、層粘蛋白、Ⅳ型膠原。前期動物實驗表明Art對CCl4混合因素造成的大鼠肝纖維化有防治作用。肝纖維化的發(fā)生原因有許多，任何致病因子造成的肝臟損害和炎癥，均可引起纖維組織增生及沉積而形成肝纖維化。大鼠免疫性肝纖維化模型更接近人類肝纖維化的病理機制［8］。實驗中觀察到大鼠在造膜結(jié)束后肝組織Masson膠原染色可見由膠原纖維構(gòu)成的纖維間隔自匯管區(qū)向肝小葉內(nèi)延伸，交織成網(wǎng)狀。經(jīng)Art預防治療后，大鼠膠原纖維增生程度明顯減輕，甚至無膠原纖維增生或僅在匯管區(qū)和中央靜脈有少量纖維組織增生，其纖維化程度明顯低于模型組。模型組肝組織Hyp含量明顯升高，而Art組明顯下降，這與肝組織形態(tài)學觀察反映出的各組肝纖維化程度相一致。

HSC的活化和增殖在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。表達α-SMA是HSC活化的標志。實驗中觀察到正常大鼠肝臟幾乎無 α-SMA mRNA的表達，肝纖維化大鼠肝組織α-SMA mRNA表達增高，而Art組可以抑制α-SMA mRNA表達，從而推斷Art抑制肝纖維化與抑制HSC活化有關(guān)。

肝細胞、Kupffer細胞、肝竇內(nèi)皮細胞等受損后釋放的TGF-β1是啟動鄰近靜息態(tài)HSCs激活和轉(zhuǎn)化的初始信號之一。而后由HSC通過自分泌方式使 TGF-β1持續(xù)增高，TGF-β1反饋作用于 HSCs，并不斷刺激自身的增殖并合成Ⅰ型膠原等各種細胞外基質(zhì)在肝內(nèi)異常沉積，最終導致肝纖維化［9］。有研究證實［10］，細胞因子中只有 TGF-β1能刺激 HSC 合成膠原纖維，而其他細胞因子則只刺激 HSC增殖。實驗當中正常大鼠肝組織幾乎未見TGF-β1表達，模型組高表達，提示TGF-β1的表達與纖維化的形成與發(fā)展是密切相關(guān)的。Art可以抑制肝組織TGF-β1mRNA的表達。

體外以 HSC-T6 為對象，用 5 μg·L-1TGF-β1刺激HSC-T6，結(jié)果所示活化后的HSC-T6對TGF-β1刺激信號仍是敏感的，經(jīng)過TGF-β1刺激，Ⅰ型前膠原mRNA表達增高，Ⅰ型膠原蛋白分泌增多，與Art共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原的量比單獨使用TGF-β1刺激時明顯減少。表明Art對HSC有直接抑制作用。其機制可能在于影響TGF-β1細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，從而下調(diào)細胞內(nèi)Ⅰ型前膠原的基因轉(zhuǎn)錄，進而抑制Ⅰ型膠原的產(chǎn)生，起到抑制肝纖維化的作用。Art對TGF-β1受體后信號通路的影響有待于進一步的研究。

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