Na+，K+-ATP酶參與大鼠皮層神經(jīng)元NMDA電流的調(diào)節(jié)

劉 倩，郭會彩，2，張麗男，王永利

腦缺血缺氧性疾病在臨床上具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高的特點，嚴重威脅著人類的健康。目前認為谷氨酸介導的興奮性細胞毒性在腦缺血缺氧的病理過程中起重要作用［1］。在神經(jīng)元缺血缺氧時，NMDA受體是介導神經(jīng)毒性最主要的受體［2-4］，谷氨酸通過NMDA受體在缺血缺氧所致的神經(jīng)元損傷中起關鍵作用［5］。

我室的前期研究已證明［6］，缺血缺氧后，腦組織不僅興奮性氨基酸釋放增多，而且Na+，K+-ATP酶活性明顯降低，其高親合力α2亞基和α3亞基，無論在mRNA水平還是蛋白水平均明顯降低，而低親和力的α1亞基則無明顯改變［7］，提示Na+，K+-ATP酶高親合力α亞基參與了腦缺血缺氧性損傷。本實驗選取對缺血較敏感的皮層神經(jīng)元，旨在探討缺氧條件下Na+，K+-ATP酶是否參與神經(jīng)元缺氧損傷所致的NMDA受體過度激活。

1 材料與方法

1.1 材料 腦片膜片鉗系統(tǒng)系德國HEKA公司產(chǎn)品。出生12～16 d的SD乳大鼠，由河北醫(yī)科大學動物中心提供。礬酸鈉(vanadate)批號:13721-39-6，購自 AlfaAesar公司;雙氫哇巴因(Dihydroouabain，DHO)批號:214-663-0，購自 Sigma公司。

人工腦脊液(ACSF)的配制(mmol·L-1):NaCl 125，KCl 3，MgCl21，NaH2PO41.25，D-Glucose 10，NaHCO325，調(diào)節(jié)滲透壓為310 mOsm。使用前以體積分數(shù)為95%O2和5%CO2混合氣充氣飽和1 h，可調(diào)節(jié)ACSF的pH值在7.4左右。

電極內(nèi)液(mmol·L-1):KCl 110，NaCl 10，HEPES 10，EGTA 0.2，Na2ATP 5，TEACL 10，用CsOH調(diào)節(jié)pH值至7.2，滲透壓為310 mOsm。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮層腦片的制備 取出生12～16 d的SD乳大鼠，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(0.1 ml/只)，將麻醉好的大鼠斷頭并迅速切取其前2/3的腦組織，利用震動切片機將腦組織切成厚約300 μm的腦片，即可用于腦片膜片鉗記錄。

1.2.2 NMDA電流記錄 電極由四步玻璃微電極拉制儀(P97，Sutter，美國)拉制而成，拉制好的電極充灌電極內(nèi)液后電阻為4～8 MΩ。整個實驗在室溫下(23±2)℃進行，設置鉗制電壓為-60 mV。所有藥物均選擇灌流給藥方法。NMDA電流(INM)為灌流含有NMDA(80 μmol·L-1)的ACSF液體所得到的誘發(fā)電流，此電流作為對照電流。孵育DHO、vanadate后的電流為INM’，兩者比較即可得到電流的抑制率。

神經(jīng)元缺氧模型的制作:在實驗前，用自制的通氣系統(tǒng)在ACSF中預先持續(xù)通以體積分數(shù)為95%N2，5%CO2氣體至少30 min，以驅(qū)除灌流液中所溶解的氧氣。取腦片，置于正常的ACSF中，實施封接，形成全細胞記錄模式后，在保持GΩ封接阻抗的條件下，用灌流系統(tǒng)持續(xù)、緩慢灌流經(jīng)上述處理過的不含氧的ACSF，造成細胞急性缺氧，觀察腦片在急性缺氧環(huán)境下通道電活動的變化。實驗中保持通氣灌流狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 皮層神經(jīng)元NMDA電流鑒別 在本實驗條件下記錄的NMDA電流為一個內(nèi)向移動電流，在灌流NMDA受體的特異性阻斷劑AP-5或MK-801后，此電流內(nèi)向移動可被基本阻斷。其中AP-5、MK-801對NMDA電流的抑制率分別為94.95%、89.17%，表明所記錄到的內(nèi)向電流確為NMDA電流，見Fig 1。

Fig 1 Effect of AP-5 or MK-801 on the NMDA current of neurons from cortical slicesA，B:NMDA current density of neurons after incubated with AP-5;C:NMDA current density of neurons after incubated with MK-801.＊＊P＜0.01 vs NMDA.

2.2 DHO對NMDA電流的調(diào)節(jié) 與對照NMDA電流相比較，無論在正?；蛉毖鯒l件下，不同濃度的DHO均能明顯抑制皮層神經(jīng)元的NMDA電流，見Fig 2，隨著 DHO 濃度(10-11～10-3mol·L-1)的不斷升高，其NMDA電流逐漸減小，而抑制率則逐漸增大。且在缺氧情況下，神經(jīng)細胞的電流密度明顯增大，見Tab 1。

Tab 1 Effects of different doses of DHO on the NMDA current of neurons from cortical slices

Fig 2 Effects of different doses of DHO on the NMDA current of neurons from cortical slices.

Fig 3A.The NMDA current after incubated with vanadate(1 μmol·L －1)in brain slices;B.The NMDA current after incubated with vanadate(1 mmol·L －1)in brain slices

Fig 4 The fit curve before and after hypoxia

以上數(shù)據(jù)表明，神經(jīng)元鈉鉀泵參與了NMDA電流的調(diào)節(jié)，其功能強弱與NMDA電流大小密切相關。但在無糖低氧處理后，孵育各濃度DHO后的NMDA電流密度均較缺氧前明顯增大，提示缺氧時神經(jīng)元NMDA電流的調(diào)節(jié)可能主要取決于興奮性氨基酸的釋放而非鈉鉀泵的功能。

2.3 vanadate對 NMDA 電流的調(diào)節(jié) 1 μmol·L-1和1 mmol·L-1vanadate能明顯抑制NMDA電流，其抑制率分別為49.25%和76.4%。進一步說明NMDA電流的調(diào)節(jié)與鈉鉀泵功能密切相關，見Fig 3。

2.4 鈉鉀泵調(diào)節(jié)NMDA電流的機制研究 我們對DHO調(diào)節(jié)NMDA電流量效關系曲線的擬合結(jié)果顯示(Fig 4)，大鼠皮層神經(jīng)元具有兩種不同親和力的鈉泵，即高親和力泵和低親和力泵。常氧灌流時的擬合參數(shù)是:kh=3.8143×10-9，kl=1.3671×10-5，fh=0.5839，fl=0.4161;缺氧情況下是:kh=2.3311 ×10-9，kl=1.1735 ×10-5，fh=0.7353，fl=0.2647。通過對擬合曲線的分析，發(fā)現(xiàn)鈉泵的高低親和力亞基均參與了DHO對NMDA電流的調(diào)節(jié);缺氧前后高親合力泵發(fā)生改變明顯，而低親合力泵改變不明顯。

3 討論

Na+，K+-ATP酶又稱為鈉泵，是一類廣泛存在于真核生物細胞膜中的跨膜蛋白。對保持細胞體積及pH、肌肉和神經(jīng)細胞的細胞膜興奮性等生理過程具有重要作用［8］。多年的研究發(fā)現(xiàn):Na+，K+-ATP酶的活性在腦缺血的早期即有明顯下降，并且隨缺血時程而遞降，從而證明腦缺血后早期Na+，K+-ATP酶活動的減低，導致了細胞內(nèi)外的離子失衡，并與細胞毒性水腫的發(fā)生有著直接的關系。

神經(jīng)細胞在孵育DHO后，NMDA電流會減小，且隨著DHO濃度的升高，NMDA電流的減小程度逐漸增加，呈濃度依賴性。另外，用Na+，K+-ATP酶的另一抑制劑vanadate灌流神經(jīng)細胞時，亦可得到相同結(jié)果。這些結(jié)果表明，NMDA電流的下調(diào)作用與抑制Na+，K+-ATP酶的活性密切相關。另外，缺氧缺血加重了細胞內(nèi)外的離子紊亂，進一步擾亂了細胞的正常功能;加上內(nèi)源性氨基酸的過量釋放，興奮神經(jīng)細胞的NMDA受體［9］，因此在缺氧缺血的情況下，DHO對NMDA電流的抑制不如在正常情況下明顯。

總之，無論在正?；蛉毖鯒l件下，DHO均能濃度依賴性抑制皮層神經(jīng)元的NMDA電流，提示鈉鉀泵參與了神經(jīng)元NMDA電流的調(diào)節(jié)，其功能強弱與NMDA電流大小密切相關。

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