從莧菜中提取氫過氧化物裂解酶工藝*

熊杰，劉慶慶，孔祥珍，張彩猛，華欲飛

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

從莧菜中提取氫過氧化物裂解酶工藝*

熊杰，劉慶慶，孔祥珍，張彩猛，華欲飛

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

在高等植物中，氫過氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase，HPL)可將脂肪氧合酶氧化多不飽和脂肪酸產(chǎn)生的氫過氧化物催化裂解，生成的己醛、己烯醛等芳香性物質(zhì)具有果蔬的新鮮氣味，是食品行業(yè)和日化工業(yè)中的重要芳香風味添加劑。實驗以莧菜為研究對象，在單因素［pH、半胱氨酸濃度、勻漿轉(zhuǎn)速、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)濃度］實驗基礎上，運用4因素3水平的正交實驗，對HPL的提取工藝進行了優(yōu)化，即在12 000 r/min，以pH 8.0的含有1 mmol/L半胱氨酸和0.3%質(zhì)量濃度的PVP為緩沖液提取HPL，得到的HPL具有很高的酶活。并探索了抽真空對HPL提取的影響，在抽真空完全除去氧的情況下提取HPL，酶活得到顯著提高。

氫過氧化物裂解酶(HPL)，莧菜，總酶活，真空

氫過氧化物裂解酶(HPL)是植物脂質(zhì)氧化途徑中重要的酶。它是植物產(chǎn)生清香風味成分基本途徑(LOX/HPL)中的關鍵性酶之一，在天然風味的合成中有重要作用。

1973年，Tressl［1］等在香蕉中首次發(fā)現(xiàn)一種可以將脂肪酸氫過氧化物裂解的酶，并將其命名為醛酶。隨后，Vick等在西瓜幼苗中也發(fā)現(xiàn)了它的存在，并進行了分離純化，后將其命名為氫過氧化物裂解酶［2］。氫過氧化物裂解酶廣泛分布于綠葉植物中，莧菜中13-HPL含量最高［3］。HPL是生產(chǎn)天然揮發(fā)性風味物質(zhì)C6醛類的關鍵酶類，然而也是此技術工業(yè)化的瓶頸。如何通過生物化學方法提高酶的活力、提取率、穩(wěn)定性以及如何在反應過程中通過合適的添加劑穩(wěn)定酶在反應過程中的性能，以獲得C6醛類合成量和轉(zhuǎn)化率的大規(guī)模提高是進一步推進此技術商業(yè)應用的突破口。本文主要以莧菜為研究對象，探究了pH值、半胱氨酸、勻漿轉(zhuǎn)速、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)濃度以及抽真空除去氧氣對氫過氧化物裂解酶總酶活的影響，得到一條提取氫過氧化物裂解酶的新工藝。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

莧菜，購于華潤萬家超市。二硫蘇糖醇(DTT)、大豆脂肪氧合酶typeⅠ-B(LOX)、亞油酸、亞麻酸、己醛、己烯醛均購于Sigma公司。其他試劑為分析純。

CRZIGII型離心機，日本日立;UV2450型分光光度計，日本島津;組織搗碎機，美國Waring公司;Delta 320s型pH計，梅特勒-托利多公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 亞油酸氫過氧化物和亞麻酸氫過氧化物的制備

100 mg亞麻酸或亞油酸溶于2 mL無水乙醇中，后轉(zhuǎn)移至預先通氧氣至飽和的100 mL 0.2 mol/L pH 9.0的硼酸鹽緩沖液中，隨后加入3 mg溶入少量的硼酸鹽緩沖液的LOX?？焖贁嚢杈鶆蚝笤诒『统掷m(xù)通氧條件下反應1.5 h，隨后用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)反應液至pH3.0以下結(jié)束反應。用等體積無水乙醚萃取反應液2次后合并有機相，加入無水MgSO4干燥，過濾后在30℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚，殘留部分為亞麻酸氫過氧化物(13-HPOT)或亞油酸氫過氧化物(13-HPOD)，將其溶于一定量乙醇，充氮后分裝于 －20℃下密封保存［4］。

1.2.2 氫過氧化物裂解酶粗酶的提取

取265g去掉根、莖，并切成小片的莧菜，與pH合適的800 mL含有一定濃度聚乙烯吡咯烷酮K－30和0.1 mmol/L的Tris-HCl緩沖液共同均漿(分6次，每次10s，間隔5s)。均漿液經(jīng)4層紗布過濾，濾液在4℃下9 000 r/min離心30 min。棄上清液取沉淀懸浮于50 mL含1 mmol/L DTT和0.5%(v/v)Triton X－100的pH 6.8的0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，稱取質(zhì)量為m，在層析柜(4℃)中攪拌30 min，在4℃下保存，供測酶活使用(由于不同批次購買的莧菜有差異，確保實驗的準確性，所以每組單因素實驗都是在同一批次的莧菜中進行)［3］。

1.2.3 氫過氧化物裂解酶酶活的測定

取5 mL，質(zhì)量為M的酶溶解液，加入到20 mL含1 mmol/L DTT和0.5%(v/v)Triton X－100的pH 6.8的0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，并在層析柜(4℃)中攪拌10 min。然后取5 μL稀釋好的酶液和10 μL 的 13-HPOT 底 物 與 pH 6.0 的 2 985 μL 0.02mol/L磷酸鹽(sodium phosphate，PBS)緩沖液混合，在波長234 nm下測定其吸光值在1 min內(nèi)的線性下降值A。空白為5 μL酶液和pH 6.0的2 995 μL 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液混合。酶活力單位定義為:每分鐘每裂解1 μmoL的13-HPOT所需的酶量(ε=25000 M－1cm－1)［5］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)至少重復3次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對HPL提取的影響

為了得到HPL的最佳提取pH，在pH6～9進行了研究，其中半胱氨酸的濃度為0，勻漿轉(zhuǎn)速為18000 r/min，PVP的濃度為0.5%，結(jié)果如圖1所示。

圖1 pH對HPL總酶活的影響

由圖1可知，隨著pH的增大，HPL總酶活先增大后減小，pH 8.0時，HPL的總酶活達到最大值。實驗中發(fā)現(xiàn)，在pH變化時，酶溶解液的顏色也在發(fā)生變化，特別是當pH變低時，酶液的顏色由深綠色變成黃綠色。這可能是在酸性條件下葉綠體中的嘌呤環(huán)上的Mg2+被H+所代替，造成了HPL粗酶液顏色和活力的下降［6］。在pH較高的情況下，由于偏離HPL酶的最適pH過大，對HPL的酶活產(chǎn)生不利的影響，導致總酶活下降。故選擇8.0為提取的pH值。

2.2 半胱氨酸對HPL提取的影響

根據(jù)基因比對，HPL應屬于細胞色素P450(cytochromeP450，CYP450)家族的一個新成員CYP74，根據(jù)同源性又可分為CYP74B和CYP74C兩種。和其他CYP450酶一樣，HPL在C末端有4個保守區(qū)域，其中保守區(qū)D含有和血紅素相連的半胱氨酸［7］。Noordermeer［8］等對重組青椒HPL中高度保守的半胱氨酸的C422進行點突變后發(fā)現(xiàn)重組蛋白不含血紅素鐵，溶解性和酶活性都降低，說明半胱氨酸和蛋白活性中心的血紅素高度相關。因此在提取HPL過程中，加入一定濃度的半胱氨酸，對HPL本身起保護作用，我們對半胱氨酸的最適濃度進行了探究，其中pH為8.0，勻漿轉(zhuǎn)速為 18000 r/min，PVP的濃度為0.5%，結(jié)果如圖2所示。

圖2 半胱氨酸濃度對HPL總酶活的影響

由圖2可知，低濃度的半胱氨酸對HPL酶活的提升沒有幫助，當達到1 mmol/L之后，對酶活提升有利。當半胱氨酸的濃度繼續(xù)升高，HPL的酶活會下降。因此，選擇1 mmol/L為半胱氨酸的最佳濃度。

2.3 勻漿轉(zhuǎn)速對HPL提取的影響

HPL通常位于植物的葉綠體或者線粒體膜上［9－10］，有研究者推測 HPL作為一種外膜蛋白，分子表面有很多小片段疏水表面殘基有助于和細胞膜形成緊密的連接［11］。因此在提取HPL時，需要將植物細胞充分破碎，使酶釋放出來。實驗采用美國Waring公司的組織搗碎機，對其轉(zhuǎn)速進行探究，其中pH為8.0，半胱氨酸濃度為1 mmol/L，PVP的濃度為0.5%，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，HPL的總酶活逐漸降低。研究表明，在溫度超過35℃后，HPL的酶活開始明顯的下降。在勻漿的過程中，由于高速攪拌會產(chǎn)生熱量，使酶提取液的溫度升高，導致酶部分失去活力，最終總酶活降低;另一方面，高速攪拌引起的剪切力產(chǎn)生疏水性氣液交界面，導致界面上的酶蛋白空間結(jié)構(gòu)被破壞，這些分子的大量疏水性氨基酸殘基暴

，， ，性失活［12］。綜合以上結(jié)果分析，選擇12000 r/min為最佳的勻漿轉(zhuǎn)速。

2.4 PVP對HPL提取的影響

在植物細胞中，含有一定量的酚酸，由于細胞的破碎這些酚酸會釋放出來，對HPL的提取產(chǎn)生不利的影響［13］。因此在提取過程中，加入一定濃度的PVP減小這種不利的影響，其中pH為8.0，半胱氨酸濃度為1 mmol/L，勻漿轉(zhuǎn)速為12000 r/min，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可得，隨著PVP濃度的增加，HPL總酶活先增加，當其濃度達到0.3%時，HPL總酶活達到最大值，PVP濃度繼續(xù)增加，HPL的酶活會逐漸降低。在低濃度下，PVP可以很有效的與原料中酚類結(jié)合保護酶活性，由于PVP溶液呈酸性，當濃度過高后，會影響緩沖液的pH，對HPL的酶活產(chǎn)生不利的影響，因此并不是PVP的濃度越高越好。綜合考慮，選擇0.3%為最佳的PVP濃度。

2.5 正交試驗優(yōu)化HPL提取的工藝

在單因素的實驗基礎上，采用4因素3水平的正交實驗，以HPL總酶活為指標，對HPL的提取工藝進行優(yōu)化。正交實驗設計及結(jié)果如表1所示。

圖3 轉(zhuǎn)速對HPL總酶活的影響

圖4 PVP濃度對HPL總酶活的影響

表1 HPL提取工藝優(yōu)化的正交實驗設計及結(jié)果

由表1中R的大小可知，pH對HPL的總酶活影響最大，其次分別為PVP濃度、轉(zhuǎn)速、半胱氨酸濃度，即各因素的影響大小順序為:A＞D＞C＞B，從表中的均值大小可以看出，提取工藝的最優(yōu)組合為A2B2C1D2，而實驗值大小可得出的最優(yōu)組合為A2B3C1D2為，兩者結(jié)果不一致，因此需要做驗證實驗來驗證。

取3份同一批次的莧菜，以最優(yōu)組合A2B2C1D2做驗證實驗，結(jié)果提取的HPL總酶活為2687U，高于表中的最優(yōu)組合A2B3C1D2的實驗結(jié)果。因此確定HPL提取的最優(yōu)組合為 A2B2C1D2，即 pH為8.0，半胱氨酸濃度為1 mmol/L，轉(zhuǎn)速為12000 r/min，PVP質(zhì)量濃度為0.3%。

2.6 勻漿抽真空對HPL提取的影響

酶分子中所含的Met，Cys，Trp及Tyr等，與各種活潑氧具有很高的反應性，極易被氧化。HPL分子中含有相當數(shù)量的氨基酸殘基，在氧分子或其他氧化劑作用下，半胱氨酸殘基的巰基易被氧化［12］。因此，在實驗過程中采用抽真空的方法，來提高HPL的酶活，其中pH為8.0，半胱氨酸濃度為1 mmol/L，勻漿轉(zhuǎn)速為12000 r/min，PVP濃度為0.3%，結(jié)果如圖5所示。

圖5 勻漿抽真空對HPL總酶活的影響

由圖5可知，勻漿過程中，短時間抽真空后充氮與不抽真空相比，HPL的總酶活有一定的提高，提高的幅度不是很大;長時間的抽真空充氮后HPL的酶活有明顯的提高，幅度達到30%。當抽真空的時間增加到2.5h后，不僅空氣中沒有氧氣，植物細胞中的氧氣也被除去，整個體系基本是無氧的，在勻漿過程中可以避免HPL與氧氣接觸而被氧化。通過這一實驗結(jié)果能夠說明，在HPL提取的過程中，氧氣會使HPL氧化失活，導致HPL的總酶活降低，在提取HPL過程中，除去氧氣后，能明顯提高HPL的總酶活。

3 結(jié)論

以莧菜為研究對象，得到一條高效提取HPL酶的工藝流程:在12 000 r/min的轉(zhuǎn)速下，以pH 8.0的含有1 mmol/L半胱氨酸和0.3%PVP為緩沖液提取HPL，得到的HPL酶具有很高的酶活。此外，在提取HPL的過程中，氧氣會使HPL氧化失活，導致HPL的總酶活降低，提取過程完全除去氧氣后，能明顯提高HPL的總酶活。

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Extraction Technology of Hydroperoxide Lyase from Amaranth tricolor

Xiong Jie，Liu Qing-qing，Kong Xiang-zhen，Zhang cai-meng，Hua Yu-fei
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

In higher plant，hydroperoxide lyase(HPL)catalyzed the cleavage of hydroperoxide，which converted from linoleic or linolenc acid by LOX，to give C6 volatile aldehyes together with ω – oxoacids.These volatile aldehydes are important contributors to the distinctive scent of fresh fruits and vegetables，C6 aldehydes are an important flavor additive in food industry and chemical industry.Based on the single－factor tests，combination of the extraction parameters was optimized by using four－factor－three－level orthogonal test.The optimum conditions were determined as follows:speed 12 000r/min，pH=8.0，contained 1mmol/L cysteine and 0.3%(m/v)PVP as a buffer.Under that condition，the total enzyme activity of HPL was high.We also explored the effect of the vacuum the extraction of HPL and found that if the HPL was extracted under the condition of complete oxygen removal，its total enzyme activity would be significantly improved.

Hydroperoxide lyase，Amaranth tricolor，total enzyme activity，vacuum

在讀碩士(華欲飛教授為通訊作者)。

*國家863計劃基金(2008AA10Z305);中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助(JUSRP10919)。

2011－09－01，改回日期:2011－10－14