納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶工藝優(yōu)化

潘進(jìn)權(quán)

納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶工藝優(yōu)化

潘進(jìn)權(quán)

(湛江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湛江 524048)

納豆芽孢桿菌是納豆發(fā)酵生產(chǎn)的主要菌種，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶特性的探討將有助于了解納豆的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程，為其提供理論指導(dǎo)。從不同納豆產(chǎn)品中分離篩選得到一株高產(chǎn)蛋白酶的納豆芽孢桿菌，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)的方法對(duì)影響其發(fā)酵產(chǎn)酶的若干因素進(jìn)行了分析，確定了相對(duì)較穩(wěn)定的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝條件:可溶性淀粉 3．41%，麩皮 2%，黃豆粉2．26%，CaCl20．2%，K2HPO40．24%，Tween 80 0．2%，pH 8．0 ～8．5;發(fā)酵溫度35～38℃，時(shí)間70 h。在優(yōu)化的培養(yǎng)基及條件下，該菌種蛋白酶的發(fā)酵單位可以達(dá)到7 200 U/mL，較優(yōu)化前提高了約2倍。

納豆芽孢桿菌 蛋白酶 發(fā)酵工藝 優(yōu)化 響應(yīng)面法

納豆是一種傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品，具有很好的保健及食療價(jià)值，這主要與該產(chǎn)品中納豆芽孢桿菌的益生作用、大豆異黃酮、活性多肽及納豆激酶等有密切的關(guān)系［1－2］。納豆芽孢桿菌是用于納豆發(fā)酵生產(chǎn)的主要菌種，屬于細(xì)菌科芽孢桿菌屬，其原始菌株與枯草芽孢桿菌相同，是枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種。在納豆的發(fā)酵生產(chǎn)中該菌可以分泌多種胞外酶，包括有淀粉酶、脂肪酶、納豆激酶及多種蛋白酶等［3］。這些酶的共同作用賦予了納豆產(chǎn)品特有的風(fēng)味，以及產(chǎn)品的保健價(jià)值。因此對(duì)這些酶的研究將有助于了解納豆的發(fā)酵工藝過(guò)程，對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)給予理論指導(dǎo)，同時(shí)也可從中發(fā)掘一些有應(yīng)用價(jià)值的新酶。雖然納豆的發(fā)酵生產(chǎn)有悠久的歷史，但是對(duì)該菌種胞外酶系的研究卻相對(duì)較少，主要的研究工作集中于該菌種益生作用的探討［4－7］，納豆激酶［8－10］的研究與開(kāi)發(fā)等。然而，對(duì)該菌種胞外蛋白酶的研究卻相對(duì)較少，僅有少數(shù)學(xué)者對(duì)該菌種的發(fā)酵產(chǎn)酶特性進(jìn)行過(guò)探討［11－13］，而對(duì)于其胞外蛋白酶的組分構(gòu)成及其催化特性卻鮮見(jiàn)報(bào)道。為了探討納豆芽孢桿菌胞外蛋白酶在納豆發(fā)酵生產(chǎn)中的作用，課題組將對(duì)納豆芽孢桿菌胞外蛋白酶系的特性進(jìn)行探討。在前期工作中，從各種納豆產(chǎn)品中分離篩選得到了一株具有蛋白酶高產(chǎn)特性的納豆芽孢桿菌，探討其發(fā)酵特性，為后續(xù)酶的分離純化及性質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌(Bacillus natto sp．):實(shí)驗(yàn)室分離保藏菌種。

斜面活化培養(yǎng)基:0．5%葡萄糖，0．5%牛肉膏，1．0% 蛋白胨，0．5%NaCl，1．5% 瓊脂，pH 7．0。液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖2%，蛋白胨 1%，牛肉膏0．5%，NaCl 0．5%，Tween 80 0．1%，pH 7．0?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖2%，大豆蛋白胨1%，硫酸銨0．5%，Na2HPO40．1%，NaH2PO40．1%，CaCl20．02%，MgSO40．1%，pH 7．0。

UV－2000型分光光度計(jì):尤尼柯上海儀器公司;SC－A型精密恒溫水浴鍋:寧波萊福公司;SPX－250B－Z型生化培養(yǎng)箱:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;HYQ45型全溫?fù)u床:武漢匯誠(chéng)生物科技有限公司。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 種子活化

菌株經(jīng)斜面活化后，接種一環(huán)于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在37℃，200 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h。

1．2．2 發(fā)酵方法

每個(gè)250 mL三角瓶中裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接種2 mL活化的液體種子，置于全溫?fù)u床于37℃，培養(yǎng)72 h。

1．2．3 單因素試驗(yàn)

分別以3%的碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉、麩皮)，2%的氮源(蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NaNO3、(NH4)2SO4、黃豆粉)，0．1% 無(wú)機(jī)鹽(MgCl2、CaCl2、ZnSO4、KH2PO4、K2HPO4)和 0．05%無(wú)機(jī)鹽(FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O)代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，并添加 0．1%Tween 80或Tween 20，其他成分保持不變，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)篩選碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽及表面活性劑。以此確定對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶有促進(jìn)作用的營(yíng)養(yǎng)成分。

1．2．4 部分析因設(shè)計(jì)

利用Minitab統(tǒng)計(jì)軟件，采用其中的2水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)上述單因素試驗(yàn)篩選到的因素做進(jìn)一步的分析，以確定對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著作用的因素，并初步考察各因素間的交互作用。

1．2．5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

利用SAS統(tǒng)計(jì)軟件，采用響應(yīng)面分析法中的中心組合設(shè)計(jì)［14］，對(duì)部分析因設(shè)計(jì)中篩選的因素做進(jìn)一步考察，以確定其最合適的取值，并由此確定發(fā)酵培養(yǎng)基的組成。

1．2．6 pH對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)其起始酸堿度到不同 pH(5．0 ～10．0)，按照 1．2．2 的方法進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，考察了培養(yǎng)基起始pH對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1．2．7 溫度對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)其起始pH到8．0，按照1．2．2 的方法分別在不同溫度(25 ～45 ℃)下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，考察了發(fā)酵溫度對(duì)納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶的影響。

1．2．8 發(fā)酵時(shí)間與納豆芽孢桿菌產(chǎn)酶的關(guān)系

采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)其起始pH到8．0，按照1．2．2 的方法在 35 ℃下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，考察發(fā)酵時(shí)間與納豆桿菌產(chǎn)蛋白酶的關(guān)系

1．2．9 蛋白酶活性測(cè)定

采用 Folin 酚法［15］:1．5 mL 離心管中加入 0．3 mL稀釋的發(fā)酵液及0．3 mL 1．5%酪蛋白(溶于0．05 mol/L pH 7．5 的緩沖液)，40 ℃ 反應(yīng) 10 min，加0．6 mL 0．4 mo1/L的三氯乙酸終止反應(yīng)，靜置15 min后14 000×g離心10 min，取上清液 0．6 mL，加入3 mL 0．4 mol/L碳酸鈉溶液及 0．6 mL福林酚試劑，于40℃顯色20 min，于680 nm測(cè)定其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活單位。

酶活定義:試驗(yàn)條件下，每分鐘水解酪蛋白釋放出1μg當(dāng)量酪氨酸所需的酶量為1個(gè)活力單位。

2 結(jié)果與討論

2．1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2．1．1 單因素試驗(yàn)

納豆芽孢桿菌利用各種碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵產(chǎn)酶的效果有所不同。相比而言，在試驗(yàn)的幾種碳源中，可溶性淀粉及麩皮發(fā)酵產(chǎn)酶的單位最高，這與枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的特點(diǎn)相似［16］。分析其原因，這可能與該菌的發(fā)酵產(chǎn)酸有關(guān)。用淀粉類碳源時(shí)，由于碳源利用速率相對(duì)較緩慢，發(fā)酵產(chǎn)酸較少，不會(huì)導(dǎo)致酸的積累而使pH大幅度下降;而用其他糖作為碳源時(shí)產(chǎn)酸速度較快，pH明顯下降，從而在一定程度上影響了酶的合成。在供試的6種氮源中，無(wú)機(jī)氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著的抑制作用，單純用無(wú)機(jī)氮源時(shí)該菌種基本上不具有產(chǎn)酶的能力;相比而言，有機(jī)氮源比較有利于發(fā)酵產(chǎn)酶，這應(yīng)該與蛋白酶的誘導(dǎo)表達(dá)特性有關(guān)系;在有機(jī)氮源中，以黃豆粉的效果最佳，這可能與該菌種長(zhǎng)期在此氮源環(huán)境中馴化有一定的關(guān)系。在試驗(yàn)的幾種無(wú)機(jī)鹽中，K2HPO4及CaCl2對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶也有明顯的促進(jìn)作用。除此外，試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，表面活性劑Tween 80對(duì)該菌的發(fā)酵產(chǎn)酶也有一定的促進(jìn)作用。

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)的結(jié)果初步確定了對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶有促進(jìn)作用的幾個(gè)因素:可溶性淀粉、麩皮、黃豆粉、K2HPO4、CaCl2及 Tween 80。

2．1．2 部分析因設(shè)計(jì)

采用部分析因設(shè)計(jì)的方法對(duì)上述篩選的因素做了進(jìn)一步的分析，以此來(lái)確定對(duì)該菌種發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著影響的因素。表1、表2、表3分別給出了部分析因設(shè)計(jì)的因素水平、試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及結(jié)果的回歸分析。

表1 部分析因設(shè)計(jì)因素水平表

表2 部分析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

從表3的分析結(jié)果可以看出:選取的6個(gè)因素均對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶表現(xiàn)出促進(jìn)作用;其中可溶性淀粉(A)，黃豆粉(B)，K2HPO4(D)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶有極顯著的作用(P＜0．01);麩皮(C)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著的作用(P＜0．05);曲率分析(表3 Ct Pt項(xiàng))的結(jié)果則表明，部分析因設(shè)計(jì)確定的試驗(yàn)空間是一個(gè)顯著的曲面響應(yīng)(P＜0．01)，其中存在最大或最小響應(yīng)點(diǎn)。為了確定此試驗(yàn)空間內(nèi)的極值響應(yīng)點(diǎn)，后續(xù)的試驗(yàn)將以因素A、B及D為對(duì)象，在表1所示的各因素水平的取值范圍內(nèi)進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)曲面分析，同時(shí)固定其他因素C、E和F的取值為中水平。

表3 部分析因試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析

2．1．3 中心組合設(shè)計(jì)

在以上試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行了中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察了可溶性淀粉(A)、黃豆粉(B)和K2HPO4(D)3者的相互作用，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示。

表4 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)表4的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，可以擬合得到以下數(shù)學(xué)模型:

分析表明，回歸模型具有非常高的顯著性(P＜0．01)，其 R2為 0．990 1，說(shuō)明該模型可以解釋99．01%的試驗(yàn)結(jié)果。圖1、圖2給出了擬合模型的響應(yīng)曲面及等高線圖，該曲面的形狀及相應(yīng)的等高線圖說(shuō)明在所選取的試驗(yàn)空間中存在最大響應(yīng)值。利用SAS軟件分析確定了該最大響應(yīng)值為(5 159．2±32．6)U/mL，其對(duì)應(yīng)的因素水平分別為可溶性淀粉3．58%，黃豆粉 2．49%，K2HPO40．234%。由此確定了納豆芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為:可溶性淀粉3．58%，黃豆粉 2．49%，麩皮 2%，K2HPO40．234%，CaCl20．2%，Tween 80 0．2%。以優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基按照1．2．2的方法進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，4次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果(5 130、5 156、5 170 和5 185 U/mL)與模型的預(yù)測(cè)值基本一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可靠性。

根據(jù)以上優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果確定了納豆芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為:可溶性淀粉3．58%，黃豆粉2．49%，麩皮 2%，K2HPO40．234%，CaCl20．2%，Tween 80 0．2%。

2．2 pH對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

考察了培養(yǎng)基起始pH對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 培養(yǎng)基起始pH對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

pH對(duì)該菌種發(fā)酵有較顯著的影響，起始培養(yǎng)基的酸性或堿性太強(qiáng)均不利于菌體產(chǎn)酶;相比而言，弱堿性的條件更有利于該菌種發(fā)酵產(chǎn)酶。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH在8．0～8．5的范圍較為合適。

2．3 溫度對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

考察了溫度對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 溫度對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

溫度對(duì)該菌發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著的影響:當(dāng)溫度低于30℃時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)酶受到明顯的抑制;溫度高于40℃時(shí)，酶的產(chǎn)量也受到一定的影響，這可能與酶的失活有關(guān);相比而言，該菌種比較合適的發(fā)酵產(chǎn)酶溫度在35～38℃范圍。

2．4 時(shí)間與納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的關(guān)系

探討了納豆芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)間與產(chǎn)酶之間的關(guān)系，結(jié)果如圖5所示。

圖5 發(fā)酵時(shí)間與菌體產(chǎn)酶的關(guān)系

在發(fā)酵的前期(20 h內(nèi))，菌體產(chǎn)酶的速度非常緩慢;發(fā)酵40 h后菌體進(jìn)入快速產(chǎn)酶期，而且產(chǎn)酶基本上以恒速進(jìn)行;發(fā)酵60 h后產(chǎn)酶速度逐漸減慢，發(fā)酵到72 h后產(chǎn)酶基本上結(jié)束，繼續(xù)發(fā)酵將導(dǎo)致酶活的下降。由此確定該菌種合適的發(fā)酵時(shí)間為70 h左右。

3 結(jié)論

在納豆發(fā)酵過(guò)程中，大豆蛋白的水解是其中一個(gè)重要的生化過(guò)程，其與納豆的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值及風(fēng)味形成有著密切的關(guān)系，因此對(duì)這一過(guò)程的探討對(duì)于該產(chǎn)品有著重要的意義。通過(guò)對(duì)不同來(lái)源的納豆產(chǎn)品進(jìn)行分離篩選，獲得了一株具有高產(chǎn)蛋白酶特性的納豆芽孢桿菌。采用單因素試驗(yàn)、部分析因試驗(yàn)、中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)酶的培養(yǎng)基及條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了較合適的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基及發(fā)酵條件:可溶性淀粉3．58%，黃豆粉2．49%，麩皮 2%，K2HPO40．234%，CaCl20．2%，Tween 80 0．2%，pH 8．0 ～8．5，溫度35 ～38 ℃，發(fā)酵70 h左右。在優(yōu)化的基礎(chǔ)上，該菌種蛋白酶發(fā)酵單位可以達(dá)到7 200 U/mL，比優(yōu)化前提高約2倍。這一結(jié)果為后續(xù)蛋白酶組分特性及催化性質(zhì)的分析奠定了工作基礎(chǔ)。

［1］段智變，董改香，溫曉慶，等．納豆及其提取物生物活性物質(zhì)測(cè)定［J］．山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28(2):181－183

［2］王莉，金學(xué)年，金成哲，等．納豆發(fā)酵過(guò)程中納豆激酶及活性物質(zhì)的變化［J］．大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27(1):5－9

［3］奚曉琦，王加啟，卜登攀，等．納豆芽孢桿菌的分離鑒定及納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選［J］．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40(11):69－75

［4］張麗靖，楊郁．1株納豆菌抑菌活性及其培養(yǎng)基優(yōu)化［J］．微生物學(xué)雜志，2010，30(1):43－46

［5］張海濤，王加啟，卜登攀，等．納豆枯草芽孢桿菌對(duì)犢牛斷奶前后瘤胃發(fā)酵和酶活的影響［J］．中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36(12):5－11

［6］鐘青萍，王發(fā)祥，鐘士清，等．納豆菌微生態(tài)制劑的穩(wěn)定性研究［J］．食品科學(xué)，2006，27(3):133－136

［7］黃占旺，黃慶．納豆菌的分離與抗菌特性研究［J］．食品科技，2003，(11):7－9

［8］王萍，杜連祥，路福平，等．溶栓納豆芽抱桿菌的篩選鑒定及產(chǎn)納豆激酶條件的研究［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(2):74－77

［9］余功保，郭愛(ài)玲，秦巧玲，等．一株高產(chǎn)納豆激酶菌株的篩選及其發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］．食品科學(xué)，2007，28(4):227－231

［10］陳曉飛，周伏忠，陳國(guó)參．納豆激酶酶學(xué)性質(zhì)研究［J］．河南科學(xué)，2010，28(1):41－43

［11］Yamagata Y，Abe R，F(xiàn)ujita Y，et al．Molecular Cloning and Nucleotide Sequence of the 90k Serine Protease Gene，hspK，from Bacillus subtilis(natto)No．16［J］．Current Microbiology 1995，31:340－344

［12］帥明，黃占旺，牛麗亞．納豆芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶固態(tài)發(fā)酵條件研究［J］．飼料工業(yè)，2008，29(8):18－20

［13］孫妍，王加啟，奚曉琦，等．高產(chǎn)蛋白酶納豆芽孢桿菌的分離篩選與鑒定［J］．沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41(2):175－180

［14］Liu Chuan － bin，Liu Yan，Liao Wei，et al．Application of statistically based experimental designs for the optimization of nisin production from whey ［J］．BioTech－nology Letters，2003，25(11):877－882

［15］Sierecha J K．Purification and partial characterization of a neutral protease from a virulent strain of Bacillus cereus［J］．The International Journal of Biochemistry＆ Cell Biology，1998，30(5):579－595

［16］李永泉，朱志成，李向晨，等．中性蛋白酶發(fā)酵工藝優(yōu)化研究［J］．微生物學(xué)通報(bào)，1995，22(3):150－154．

Technical Optimization of Protease Production by Bacillus Natto

Pan Jinquan
(School of Life Science and Tech－nology，ZhanJiang Normal University，Zhanjiang 524048)

Bacillus natto was the primary microorganism used in the production of natto，and the study on the process of protease production from Bacillus natto might help to conduct the production of natto．One Bacillus natto of high－yield protease was isolated from natto，and its protease production process was optimized using the response surface methodology．After optimization，the optimum fermentation medium and conditions were obtained:soluble amylum 3．41%，wheat bran 2%，soybeans powder 2．26%，CaCl20．2%，K2HPO40．24%，Tween 80 0．2%，pH 8．0 ～8．5，fermentation temperature 35 ～38 ℃ and time 70 h．Under these optimized conditions，the maximum protease production reached 7 200 U/mL，which increased 2 times than that under the initial conditions．

Bacillus natto，protease，fermentation process，optimization，response surface methodology

Q939．97

A

1003－0174(2011)09－0033－05

時(shí)間:2011－07－06 17:00

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www．cnki．net/kcms/detail/11．2864．TS．20110726．1700．001．html

CNKI:11 －2864/TS．20110726．1700．001

廣東省自然科學(xué)基金(9452404801001943)，湛江師范學(xué)院基金(ZL0912)

2010－12－19

潘進(jìn)權(quán)，男，1978年出生，講師，酶與發(fā)酵工程