Toll樣受體4/核因子-κB對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥和重構(gòu)的影響*

韋江紅, 莫碧文, 黃劍偉

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西 桂林 541001)

Toll樣受體4/核因子-κB對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥和重構(gòu)的影響*

韋江紅, 莫碧文△, 黃劍偉

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西 桂林 541001)

目的： 探討TLR4/NF-κB對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重構(gòu)的影響。方法將18只SD大鼠隨機(jī)分成3組:對(duì)照組、哮喘4周組和哮喘8周組,每組6只。造模成功后，利用HE染色、免疫組織化學(xué)方法及病理圖像分析系統(tǒng)分析大鼠氣道平滑肌的嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)浸潤(rùn)情況、氣道壁厚度以及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和Bcl-2的蛋白表達(dá)量。利用RT-PCR和Western blotting檢測(cè)ASM中TLR4和NF-κB的mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果哮喘4周組和哮喘8周組的氣道壁EOS計(jì)數(shù)、氣道壁厚度、氣道反應(yīng)性均較正常對(duì)照組顯著增加(Plt;0.01)；哮喘4周組和哮喘8周組的TLR4及NF-κB的mRNA水平和蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較均顯著增加(Plt;0.01)；TLR4及NF-κB的mRNA水平隨哮喘天數(shù)的增加而顯著增加(Plt;0.01)；哮喘4周組、哮喘8周組PCNA和Bcl-2的蛋白表達(dá)量均顯著高于正常對(duì)照組(Plt;0.01)；哮喘兩組間上述指標(biāo)差異顯著(Plt;0.05或Plt;0.01)。結(jié)論TLR4/NF-κB可能參與哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重構(gòu)的調(diào)控。

Toll樣受體4； 哮喘； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡

支氣管哮喘(以下簡(jiǎn)稱哮喘)是世界范圍內(nèi)一種常見多發(fā)性慢性氣道炎癥性疾病，迄今它的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確。大量研究顯示，Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是天然免疫和獲得性免疫之間的橋梁[1]，在哮喘的發(fā)生發(fā)展中可能起著較為重要的作用[2]。核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是一種普遍存在于細(xì)胞質(zhì)中的重要的、多向性的核轉(zhuǎn)錄因子，其位于TLRs下游信號(hào)通路的樞紐位置，參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖與分化等過程。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)TLR4的研究均局限于體外實(shí)驗(yàn)，即對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)功能的研究，未見整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究，因此，我們將建立哮喘動(dòng)物模型，從整體水平探討TLR4/NF-κB對(duì)哮喘氣道炎癥和氣道重構(gòu)及平滑肌增殖、凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1材料

SPF級(jí)SD大鼠(雄性，200-250 g)由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；戊巴比妥鈉、卵清白蛋白、氫氧化鋁凝膠和多聚甲醛均為Sigma產(chǎn)品；滅活百日咳桿菌為北京生物研究所提供；Taq DNA聚合酶、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、隨機(jī)引物(random primer)、瓊脂糖和焦碳酸二乙酸均由大連寶生公司提供；PCR特異引物、內(nèi)參照β肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物及特異性引物均由上海生物工程有限公司合成；地塞米松為揚(yáng)子藥業(yè)產(chǎn)品； PCNAⅠ抗、Bcl-2Ⅰ抗和TLR4Ⅰ抗購(gòu)自武漢博士德公司；通用蛋白裂解液、吐溫20、考馬斯亮藍(lán)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自碧云天公司；PCR儀為MJ Research Co產(chǎn)品；低溫高速離心機(jī)為Beckman產(chǎn)品，紫外分光光度儀為Biochrom產(chǎn)品；GBOX HR型全自動(dòng)凝膠圖像分析儀為德國(guó)產(chǎn)品；Image-Pro Plus 6.0 病理圖像分析軟件為PDA；402AI型超聲霧化器為江蘇省魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；小動(dòng)物解剖器械由上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司手術(shù)器械廠提供；BG-SUBMINI水平電泳儀和BG-VERMINI垂直電泳儀均為Baygene產(chǎn)品。

2方法

2.1哮喘大鼠模型的建立 第1、8 d將每只大鼠于皮下注射10 mg卵清蛋白(ovalbumin,OVA)和200 mg氫氧化鋁凝膠(混合于1 mL PBS緩沖液)，同時(shí)腹腔注射5×109個(gè)滅活百日咳桿菌致敏大鼠。于第15 d開始激發(fā)：將大鼠置于一密閉容器中，予2％OVA磷酸鹽緩沖液50 mL霧化吸入刺激，每天1次，每次30 min。誘喘成功后大鼠出現(xiàn)煩躁不安，進(jìn)而呼吸加快、加深，靜伏不動(dòng)、弓背，嚴(yán)重者伸頸、縮胸、收縮呈喘息狀，甚至大小便失禁等。對(duì)照組則以磷酸鹽緩沖液代替致敏原注射和霧化吸入。

2.2實(shí)驗(yàn)分組 將18只SD大鼠隨機(jī)分成3組，每組6只。A組(對(duì)照組)：霧化吸入生理鹽水4周；B組(哮喘4周組)：每天激發(fā)哮喘1次，共4周；C組(哮喘8周組)：每天激發(fā)哮喘1次，共8周。

2.3氣道反應(yīng)性的測(cè)定 氣管切開插管，接三通管。一管連接動(dòng)物呼吸機(jī)，潮氣量10 mL/kg，頻率60次/min；一管連接呼吸機(jī)測(cè)壓管道?？芍苯訙y(cè)氣道壓力，讀數(shù)。將鹽酸組胺配成1.28 g/L，然后雙倍稀釋至0.01 g/L。首先將PBS經(jīng)霧化器噴入氣管插管內(nèi)，記錄氣管內(nèi)壓(airway pressure,Paw)，然后將鹽酸組胺的磷酸緩沖液從低濃度開始噴入，1 min開始測(cè)壓。若Paw升高不到PBS對(duì)照的20％，間隔10 min噴入下一濃度，直到Paw升高20％為止。此時(shí)，所需霧吸組胺濃度作為PC20的值。

2.4標(biāo)本的制備 上述各組大鼠，最后1次激發(fā)后24 h內(nèi)，分別測(cè)定氣道阻力，后立即行腹主動(dòng)脈放血處死，開胸迅速剝離右肺，分離氣道平滑肌(airway smooth muscle，ASM)-80℃凍存，用于RT-PCR測(cè)定及Western bloting；左肺氣管內(nèi)注入4％多聚甲醛約6 mL固定，并置4％多聚甲醛中保存，石蠟包埋備做常規(guī)HE染色及免疫組織化學(xué)染色。(1) HE染色：經(jīng)脫蠟、脫水的肺組織石蠟切片，蘇木素染色，70％鹽酸乙醇分化，流水沖洗10 min，1％NaHCO 液中漂洗至藍(lán)紫色，伊紅染色5 s，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。(2)氣道壁嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophils,EOS)計(jì)數(shù):石蠟切片作常規(guī)HE染色后,選擇結(jié)構(gòu)較完整的支氣管壁，由同一觀察者隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(×400)下支氣管壁EOS數(shù)，取其均數(shù)。(3)氣道壁厚度的測(cè)定：取各組HE染色左肺3-4級(jí)完整支氣管，測(cè)量管腔的內(nèi)周長(zhǎng)(perimeter inner,Pi)、管壁面積(wall area,WA)、支氣管平滑肌面積(smooth muscle area,SMA)和支氣管平滑肌細(xì)胞核數(shù)(the number of bronchial smooth muscle nucleus,N)。將測(cè)得的后3個(gè)值用Pi進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，分別以WA/ Pi、SMA/ Pi和N/ Pi 表示。

2.5RT-PCR檢測(cè)TLR4及NF-κB的mRNA水平 取分離的ASM立即在液氮下研磨，加入RNA提取試劑Trizol(Invitrogen)抽提RNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。產(chǎn)物mRNA于-80 ℃保存，用于一步法RT-PCR。

① TLR4 RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng) TLR4上游引物5’-CGCTTTCACCTCTGCCTTCACTACAG-3’，下游引物5’- ACACTACCACAATAACCTTCGGCTC -3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為270 bp。β-actin上游引物5’- GATTACTGCTCTGGCTCCTGC-3’，下游引物5’-GAC-TCATCGTACTCCTGCTTGC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為150 bp。嚴(yán)格按大連寶生生物公司DRR024A一步法RT-PCR反應(yīng)體系說明書操作。TLR4和β-actin的上、下游引物各1 μL，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳。

② NF-κB PCR擴(kuò)增反應(yīng) NF-κB上游引物5’-GCACGGATGACAGAGGCGTGTATAAGG-3’,下游引物5’- GGCGGATGATCTCCTTCTCTCTGTCTG -3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為420 bp。β-actin上游引物5’- GATTACTGCTCTGGCTCCTGC-3’，下游引物5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為190 bp。嚴(yán)格按大連寶生生物公司DRR024A一步法RT-PCR反應(yīng)體系說明書逐步操作，NF-κB和β-actin的上、下游引物各1 μL，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳。

③ 瓊脂糖電泳 反應(yīng)成功后，取5 μL PCR產(chǎn)物加1μL DNA上樣緩沖液和PCR marker，點(diǎn)樣在2％瓊脂糖凝膠的樣板孔中，凝膠中含有0.5 mg/L的溴化乙啶(EB)顯色，電泳電壓0.8 V/cm，時(shí)間30 min。電泳結(jié)束后，采用GBOX HR型全自動(dòng)圖像分析儀對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析：分別測(cè)定每一個(gè)目的基因及看家基因β-actin的吸光度值，取目的基因與β-actin吸光度值的比值。

2.6Western bloting檢測(cè)ASM中TLR4蛋白的表達(dá) 支氣管平滑肌經(jīng)機(jī)械分散后通用蛋白裂解液提取支氣管平滑肌總蛋白，用Bradford法測(cè)定總蛋白濃度，分裝，-80 ℃凍存，待測(cè)。聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟如下：取40 μg蛋白質(zhì)樣品(使用前煮沸變性)上樣后，先以10 V/cm電壓電泳，溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，

改電壓為18 V/cm。電泳結(jié)束后取出分離膠，安裝半干式電轉(zhuǎn)移儀，轉(zhuǎn)膜。取出硝酸纖維素膜，加入封閉液，搖床上室溫孵育1 h。棄封閉液，將膜放入塑料袋中，加入Ⅰ抗稀釋溶液(兔抗鼠TLR4抗體：稀釋度1∶1 000)，搖床上室溫孵育4 h。孵育結(jié)束回收Ⅰ抗，用TBST漂洗濾膜3次，10 min/次。然后，加入TBS及Ⅱ抗稀釋溶液(羊抗兔IgG，稀釋度1∶100)，搖床上室溫孵育2 h。取出，TBST中室溫漂洗，共3次，10 min/次。最后加入底物顯色液，待蛋白條帶顏色深度適當(dāng)，即用PBS緩沖液漂洗，將濾膜用GBOX HR凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描讀取各條帶的吸光度(A)值。

2.7增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)及凋亡蛋白Bcl-2的免疫組織化學(xué)染色 取石蠟切片后根據(jù)SP法染色試劑盒說明步驟進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，Ⅰ抗分別選用小鼠抗大鼠PCNA和Bcl-2單克隆抗體，稀釋度均為1∶200。陰性對(duì)照選用PBS緩沖液代替Ⅰ抗，其它步驟相同。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1肺組織HE染色及氣道壁EOS浸潤(rùn)情況

哮喘4周組、哮喘8周組大鼠肺組織HE染色可見細(xì)支氣管及血管周圍、肺泡腔、肺泡隔內(nèi)大量EOS浸潤(rùn)，細(xì)支氣管腔內(nèi)有過度分泌的黏液；黏膜下層和平滑肌層增厚，管腔變形狹窄；基底膜有大量的膠原沉積。正常對(duì)照組無明顯炎癥反應(yīng)，肺泡腔以及肺間質(zhì)內(nèi)未見到EOS，基底膜膠原沉積很少，見圖1。

Figure 1.HE staining of lung tissues in the three groups(×400).A:control group; B: asthmatic 4 weeks group; C: asthmatic 8 weeks group.

哮喘4周組、哮喘8周組的氣道壁EOS計(jì)數(shù)均較正常對(duì)照組顯著增加(均Plt;0.01)，且隨哮喘天數(shù)的增加EOS計(jì)數(shù)也有增加的趨勢(shì)，且兩組間比較差異顯著(Plt;0.05)，見表1。

表1 各組大鼠氣道壁EOS浸潤(rùn)情況及氣道反應(yīng)性比較

2支氣管壁厚度、支氣管平滑肌厚度及支氣管平滑肌細(xì)胞核數(shù)量的比較

哮喘4周組及哮喘8周組支氣管壁厚度(WA/Pi)、支氣管壁平滑肌厚度(SMA/Pi)和支氣管壁平滑肌細(xì)胞核數(shù)量(N/Pi)均較正常對(duì)照組顯著增加(Plt;0.01)，且隨哮喘天數(shù)的增加上述指標(biāo)亦有增加趨勢(shì)，哮喘8周組較哮喘4周組顯著增加(Plt;0.01)，見表2。

表2 各組大鼠WA/Pi、平滑肌的面積/Pi和N/Pi的比較

3氣道反應(yīng)性變化

比較各組大鼠氣道反應(yīng)性結(jié)果顯示：哮喘4周組和哮喘8周組的氣道反應(yīng)性均顯著高于正常對(duì)照組(Plt;0.01)，哮喘8周組氣道反應(yīng)性較哮喘4周組顯著增高(Plt;0.01)，見表1。

4RT-PCR檢測(cè)ASM中TLR4及NF-κB的mRNA水平。

各組電泳圖經(jīng)掃描發(fā)現(xiàn): 哮喘4周組和哮喘8周組的TLR4及NF-κB的mRNA水平顯著高于對(duì)照組(Plt;0.01)；TLR4及NF-κB的mRNA水平隨哮喘天數(shù)的增加而顯著增加(Plt;0.01)；見表3、圖2、3。

5Westernblotting檢測(cè)ASM中TLR4蛋白的表達(dá)

各組電泳圖經(jīng)掃描發(fā)現(xiàn): 哮喘4周組和哮喘8周組ASM的TLR4蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(Plt;0.01)；哮喘8周組的TLR4蛋白表達(dá)顯著高于哮喘4周組(Plt;0.01)，TLR4蛋白水平隨哮喘天數(shù)的增加而顯著增加，見表3、圖4。

表3 各組大鼠ASM中 TLR4 mRNA 和NF-κB mRNA 以及TLR4蛋白表達(dá)比較

Figure 2.RT-PCR amplification of TLR4 mRNA in airway smooth muscle.M: marker; A: asthmatic 8 weeks group; B:asthmatic 4 weeks group; C: control group.

Figure 3.RT-PCR amplification of NF-κB mRNA in airway smooth muscle.M: marker; A:asthmatic 8 weeks group; B: asthmatic 4 weeks group; C: control group.

Figure 4.Western blotting amplification of TLR4 protein in airway smooth muscle.A: asthmatic 8 weeks group; B: asthmatic 4 wees group; C: control.

6ASMCsPCNA及Bcl-2免疫組化染色結(jié)果

PCNA以細(xì)胞核棕黃色染色為陽性，主要在各組大鼠氣道上皮細(xì)胞和ASMCs表達(dá)。對(duì)照組氣道上皮細(xì)胞和ASMCs中PCNA陽性表達(dá)數(shù)較少，哮喘4周組和哮喘8周組PCNA的蛋白表達(dá)量均顯著高于正常對(duì)照組(Plt;0.01)，且哮喘兩組間差異顯著(Plt;0.05);Bcl-2以細(xì)胞核棕黃色染色為陽性，主要在各組大鼠氣道上皮細(xì)胞和ASMCs表達(dá)。哮喘4周組和哮喘8周組Bcl-2的蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比顯著增高(Plt;0.01),且哮喘兩組間差異顯著(Plt;0.05)，見表4、圖5、6。

表4 各組大鼠PCNA和Bcl-2蛋白表達(dá)量比較

Figure 5.The expression of PCNA protein in airway smooth muscle in the three groups(immunohistochemical staining,×400).A:control group; B: asthmatic 4 weeks group; C: asthmatic 8 weeks group.

Figure 6.The expression of Bcl-2 protein in airway smooth muscle in the three groups(immunohistochemical staining，×400).A: control group ；B: asthmatic 4 weeks group；C :asthmatic 8 weeks group.

討 論

哮喘是由多種細(xì)胞(如嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾患[3-5]。哮喘的特征性病理改變表現(xiàn)為氣道炎癥和氣道重構(gòu)。氣道炎癥是以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的過敏反應(yīng)性炎癥，其可加重氣道高反應(yīng)性[6]。TLRs是重要的細(xì)胞膜受體，HASMCs表達(dá)TLR1-TLR10 mRNA。TLR4被激活后可以將胞外信號(hào)傳入胞內(nèi)從而激活下游信號(hào)分子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[7]。NF-κB位于TLRs下游信號(hào)通路的樞紐位置參與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。TLRs對(duì)哮喘的作用越來越受到重視，成為揭示哮喘發(fā)病機(jī)制的一個(gè)新的可能途徑。

通過HE染色結(jié)果顯示：發(fā)現(xiàn)OVA抗原致敏激發(fā)能使SD大鼠EOS數(shù)量、氣道反應(yīng)性顯著高于對(duì)照組；且隨哮喘天數(shù)的增加而明顯增加。此外，經(jīng)標(biāo)化后的氣道壁和平滑肌層厚度的測(cè)量數(shù)值可以消除不同個(gè)體及不同部位來源的支氣管比較時(shí)所造成的差別，是判斷氣道重構(gòu)的客觀指標(biāo)。而我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：哮喘4周組及哮喘8周組支氣管壁厚度(WA/Pi)、支氣管壁平滑肌厚度(SMA/Pi)、支氣管壁平滑肌細(xì)胞核數(shù)量(N/Pi)均較正常對(duì)照組顯著增加，且隨哮喘天數(shù)的增加上述指標(biāo)亦有增加趨勢(shì)，提示哮喘SD大鼠模型復(fù)制成功，哮喘時(shí)氣道存在炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、ASM組織發(fā)生增厚同時(shí)伴發(fā)氣道高反應(yīng)性。

通過免疫組織化學(xué)、RT-PCR、Western bloting分子生物學(xué)技術(shù)研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，哮喘4周組及哮喘8周組大鼠ASM中TLR4的陽性表達(dá)、TLR4 mRNA和TLR4蛋白的表達(dá)水平要顯著高于對(duì)照組，且隨哮喘天數(shù)的增加而顯著增加。EOS計(jì)數(shù)、氣道反應(yīng)性改變與相應(yīng)各組大鼠ASM中TLR4的陽性表達(dá)、TLR4 mRNA和TLR4蛋白的表達(dá)水平一致，因此我們推測(cè)，OVA作為抗原刺激能促進(jìn)哮喘大鼠ASM中TLR4的表達(dá)，參與哮喘的氣道炎癥，并在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用。而哮喘4周組及哮喘8周組NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組比較，顯著增高，提示TLR4表達(dá)的增加可能誘導(dǎo)NF-κB的活化，說明NF-κB作為TLR4的下游信號(hào)分子存在。其機(jī)制可能是TLRs結(jié)合配體后，通過TIR域(Toll/ IL-1R域)招募MyD 88(Myeloid differentiation factor 88),MyD88再通過氨基端死亡區(qū)域的嗜同種反應(yīng)募集下游IRAK家族成員，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和/或AP-1，引發(fā)促炎細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，釋放細(xì)胞因子，產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng):調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等基因的轉(zhuǎn)錄[8]。國(guó)內(nèi)學(xué)者證實(shí)NF-κB參與哮喘大鼠 ASMCs增殖,抑制 NF- κ B 活性能降低哮喘大鼠ASMCs增殖[9]。氣道重構(gòu)是頑固性哮喘的重要病理生理基礎(chǔ)[10]，而哮喘時(shí)ASMCs增殖是氣道重構(gòu)的重要原因，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[11]。哮喘大鼠發(fā)生氣道重構(gòu)，與各組大鼠ASM中TLR4、NF-κB的mRNA和TLR4蛋白的表達(dá)水平一致，我們推測(cè)TLR4/NF-κB可能通過促進(jìn)ASMCs增生、增厚，參與哮喘氣道重構(gòu)過程。

ASMCs的增殖增加和凋亡抑制是氣道壁增厚、氣道重構(gòu)的重要病理基礎(chǔ)。PCNA是一種與細(xì)胞增殖有關(guān)的參與DNA合成的核蛋白，是僅能在增殖細(xì)胞中合成和表達(dá)的36 kD核內(nèi)多肽鏈。PCNA的表達(dá)與細(xì)胞增殖狀態(tài)、分化活躍程度有關(guān)，是一個(gè)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞增殖功能的敏感指標(biāo)。Bcl-2是重要的抑制凋亡蛋白。因此，我們選用其PCNA和 Bcl-2作為ASMCs增殖和凋亡的檢測(cè)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：哮喘4周組和哮喘8周組PCNA的蛋白表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，且隨哮喘天數(shù)的增加而增高，表明哮喘ASM增殖與PCNA的表達(dá)水平增加有關(guān)。哮喘4周組和哮喘8周組Bcl-2的表達(dá)量與對(duì)照組相比也顯著增高，且隨哮喘天數(shù)的增加而增高，提示哮喘大鼠ASM存在凋亡不足。這一結(jié)果與TLR4和NF-κB在各組ASM中的表達(dá)情況相一致，我們推測(cè)ASM的PCNA和Bcl-2的蛋白表達(dá)量受TLR4和NF-κB的調(diào)控。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推測(cè)TLR4/NF-κB參與ASMCs的增殖、凋亡，在哮喘的氣道重構(gòu)中起重要作用。

綜上所述，我們的研究結(jié)果初步顯示TLR4/NF-κB可能參與哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重構(gòu)；TLR4/NF-κB可能參與哮喘大鼠ASMCs增殖、凋亡的調(diào)控。

[1]Takeda K,Akira S.Toll-like receptors in innate immunity[J].Int Immunol,2005,17(1):1-14.

[2]Schr?der NW,Maurer M.The role of innate immunity in asthma leads and lessons from mouse models[J].Allergy,2007,62(6):579-590.

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組.支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義、診斷、治療和管理方案)[J].中華哮喘雜志(電子版),2008,2(1): 3-13.

[4]陳 健，戴愛國(guó)，胡瑞成，等．支氣管哮喘豚鼠BALF炎癥細(xì)胞中PPARγ、Nrf2和γ-GCS-h表達(dá)的變化[J].中國(guó)病理生理雜志，2010，26(4):760-765.

[5]伍 蕊，陳亞紅，姚婉貞，等.硫化氫供體對(duì)急性支氣管哮喘大鼠尾加壓素Ⅱ表達(dá)的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2010，26(9):1781-1785.

[6]王吉耀.內(nèi)科學(xué)[M].第1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.49-50.

[7]Sukkar MB,Xie S,Khorasani NM,et al.Toll-like receptor 2,3,and 4 expression and function in human airway smooth muscle[J].J Allergy Clin Immunol,2006,118(3):641-648.

[8]Akira S,Takeda K.Toll-like receptor signalling[J].Nat Rev Immunol,2004,4 (7) : 499 - 511.

[9]許淑云，徐永健，張珍祥，等.核因子κB 在支氣管哮喘模型大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖中的作用[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2006,35(5)：566-569.

[10]Krymskaya VP,Goncharova EA,Ammit AJ,et al.Src is necessary and sufficient for human airway smooth muscle cell proliferation and migration[J].FASEB J,2005,19(3) : 428-430.

[11]Ammit AJ,Panettieri RA Jr.Airway smooth muscle cell hyperplasia: a therapeutic target in airway remodeling in asthma?[J].Prog Cell Cycle Res,2003,5: 49 -57.

EffectofTLR4/NF-κBonairwayinflammationandairwayremodelinginratmodelofasthma

WEI Jiang-hong,MO Bi-wen,HUANG Jian-wei

(DepartmentofRespiratoryMedicine,HospitalAffiliatedtoGuilinMedicalCollege,Guilin541001,China.E-mail:Mobiwen2002@sohu.com)

AIM: To explore the effect of TLR4/NF-κB on airway inflammation and airway remodeling in a rat asthma model.METHODSEighteen SD rats were divided into 3 groups (n=6): control group,asthmatic 4 weeks group and asthmatic 8 weeks group.The methods of HE staining,immunohistochemistry and pathology image analysis were used to detect the changes of eosinophile granulocytes (EOS),the thickness of airway wall and the expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA) and Bcl-2 in the airway smooth muscle in asthmatic rats.The expression of TLR4 and NF-κB at mRNA and protein levels in the airway smooth muscle was determined by RT-PCR and Western blotting.RESULTSThe EOS,the thickness of airway wall and airway reactivity in asthmatic group were significantly higher than those in control group.The expression of TLR4 and NF-κB at mRNA and protein levels in asthmatic group was significantly higher than those in control group.The protein levels of PCNA and Bcl-2 were significantly higher than those in control group.Significant difference between two asthmatic groups was observed in the above indexes.CONCLUSIONTLR4 /NF-κB may regulate the airway inflammation and airway remodeling in asthmatic rats.

Toll-like receptor 4; Asthma; Cell proliferation; Apoptosis

1000-4718(2011)05-0962-06

R562.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.024

2010-10-14

2011-03-07

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30760083)；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.桂科攻0719006-2-8)；廣西衛(wèi)生廳基金資助項(xiàng)目(No.重200732;No.重200976)；桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.20080320-1)；廣西青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.桂科青0991085)；桂林醫(yī)學(xué)院2009年碩士研究生科研創(chuàng)新資助項(xiàng)目(No.555);廣西醫(yī)療衛(wèi)生自籌基金資助項(xiàng)目(No .Z2008266)

△通訊作者 Tel：0773-2823748;E-mail：Mobiwen2002@sohu.com