P53結(jié)合位點(diǎn)對(duì)人NOD8基因的調(diào)控*

曾 琪， 張 蕓， 田 莉， 唐清亮， 胡巢鳳△， 柏志全

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1病理生理學(xué)系,國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2生理學(xué)系，廣東 廣州 510632)

P53結(jié)合位點(diǎn)對(duì)人NOD8基因的調(diào)控*

曾 琪1▲， 張 蕓1▲， 田 莉1， 唐清亮1， 胡巢鳳1△， 柏志全2

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院1病理生理學(xué)系,國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2生理學(xué)系，廣東 廣州 510632)

目的： 探討P53結(jié)合位點(diǎn)在NOD8基因調(diào)控中的作用。方法利用生物信息學(xué)方法，我們發(fā)現(xiàn)人與黑猩猩的NOD8基因核心啟動(dòng)子區(qū)域相似位置含有P53結(jié)合位點(diǎn)；以人基因組DNA為模板, PCR擴(kuò)增含有人NOD8基因序列，構(gòu)建含有/缺失人P53結(jié)合位點(diǎn)的NOD8基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的、表達(dá)綠色熒光蛋白-NOD8融合蛋白的質(zhì)粒pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8和mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8；將構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)陽離子聚合物JetPeiTM介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞中，并加入不同濃度的P53抑制劑pifithrin alpha(PFT-α)處理HEK293細(xì)胞，用RT-PCR和Westren blotting 方法檢測(cè)NOD8 mRNA和蛋白的表達(dá)；此外，用pNOD8(760 bp)-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，利用染色質(zhì)免疫共沉淀法(ChIP)觀察P53是否與NOD8啟動(dòng)子結(jié)合。結(jié)果經(jīng)酶切鑒定和序列測(cè)定證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)P53能與NOD8啟動(dòng)子結(jié)合。 pNOD8 (760 bp)-EGFP-NOD8 轉(zhuǎn)染組中NOD8 mRNA的表達(dá)顯著高于pEGFP-C2轉(zhuǎn)染組(Plt;0.05)，并且NOD8 mRNA 在缺失人P53結(jié)合位點(diǎn)的mpNOD8 (750 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)明顯降低(Plt;0.01)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)加入 PFT-α的pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8 轉(zhuǎn)染組NOD8 mRNA的表達(dá)顯著下降，并呈劑量依賴關(guān)系，其中90 μmol/L PFT-α 對(duì)NOD8 mRNA表達(dá)的抑制作用最為顯著(Plt;0.01)。與mRNA檢測(cè)結(jié)果一致的是pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8 轉(zhuǎn)染組NOD8蛋白的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組pEGFP-C2； 而mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組NOD8蛋白的表達(dá)量明顯低于pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組和加入 PFT-α的pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8 轉(zhuǎn)染組(Plt;0.01)。結(jié)論P(yáng)53結(jié)合位點(diǎn)在NOD8基因調(diào)控中起著重要的作用，并且P53結(jié)合位點(diǎn)與NOD8基因之間可能存在正反饋調(diào)節(jié)。

啟動(dòng)子; 基因,NOD8; P53 結(jié)合位點(diǎn); 核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體

在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)逐步形成一套復(fù)雜的防御系統(tǒng)，包括天然免疫和獲得性免疫。天然免疫系統(tǒng)通過模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)對(duì)病原體進(jìn)行識(shí)別,從而發(fā)揮固有免疫作用[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)的核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding and oligomerization domain, NOD)樣受體(NOD-like receptors, NLRs)是胞內(nèi)受體，NLRs家族由20多個(gè)成員組成，它們的主要特征是具有N末端的CARD(caspase-recruitment domain)結(jié)構(gòu)域或pyrin結(jié)構(gòu)域(pyrin domain， PYD)，位于中央的NOD以及C-末端富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeat, LRR)。LRRs識(shí)別細(xì)菌肽聚糖的部分結(jié)構(gòu)，為病原細(xì)胞之間蛋白-蛋白的相互作用提供支架并調(diào)節(jié)蛋白的激活[2]。N-末端CARD結(jié)構(gòu)域或PYD與接頭蛋白R(shí)ICK或ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)相互作用，激活NF-κB，引起炎癥反應(yīng)[3-5]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)一種在體外具有抗炎活性的新型NLRs,它由N末端的PYD和中間的NOD組成，與該家族的其它蛋白不同之處是C-末端缺乏作為配體識(shí)別區(qū)域的富含亮氨酸的重復(fù)序列LRRs，故被命名為NOD8(也稱PYNOD、NLRP10、NALP10、CLR11.1或PAN5)[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)NOD8可抑制由caspase-1介導(dǎo)的IL-1β的分泌以及抑制ASC介導(dǎo)的NF-κB的活化和細(xì)胞凋亡。這是NLR家族中首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的對(duì)炎癥起負(fù)調(diào)節(jié)作用的成員。

我們應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)不同種屬的NOD8啟動(dòng)子內(nèi)保守序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在人與黑猩猩的NOD8基因核心啟動(dòng)子區(qū)域相似位置含有P53結(jié)合位點(diǎn)，P53作為生理和病理過程中的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控著許多免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)子。本研究將構(gòu)建含有/缺失P53結(jié)合位點(diǎn)的人NOD8基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的、表達(dá)綠色熒光蛋白-NOD8融合蛋白表達(dá)載體，探討P53結(jié)合位點(diǎn)是否在NOD8基因調(diào)控中發(fā)揮作用。

材 料 和 方 法

1材料

質(zhì)粒pEGFP- C2和大腸桿菌E.coliDH5α為本室保存； DNA多聚酶Pyrobest、dNTP、Trizol裂解液及相關(guān)的buffer購(gòu)自大連TaKaRa；限制性內(nèi)切酶XhoI和KpnI為MBI產(chǎn)品；T4 DNA 連接酶購(gòu)自Promega；DNA marker 等為北京普博公司產(chǎn)品。質(zhì)粒小量抽提試劑盒，PCR 產(chǎn)物純化及膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega；pifithrin alpha(PFT-α)為 Calbiochem產(chǎn)品；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)為Sigma產(chǎn)品；細(xì)胞轉(zhuǎn)染所用的陽離子聚合物JetPeiTM為Polyplus產(chǎn)品；HEK293購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM為HyClone產(chǎn)品, 胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品;所用抗體均購(gòu)自Santa Cruz。常用試劑中電泳及分離試劑均為分析純?cè)噭┡渲啤?/p>

2方法

2.1pNOD8(760)-EGFP和mpNOD8(750)-EGFP質(zhì)粒的構(gòu)建 這2個(gè)質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)前期構(gòu)建。根據(jù)GenBank提供的NOD8基因組序列(序列號(hào)NM_176821)和所選用的質(zhì)粒pEGFP-C2設(shè)計(jì)合成引物，所擴(kuò)增啟動(dòng)子區(qū)域的片段大小為760 bp，其中包括了P53結(jié)合位點(diǎn)(GGCAAATGGG)；構(gòu)建了NOD8基因啟動(dòng)子pNOD8(760)-EGFP質(zhì)粒；并在此質(zhì)粒上將P53結(jié)合位點(diǎn)缺失突變，構(gòu)建了突變質(zhì)粒mpNOD8(750)-EGFP[8]。

2.2染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)驗(yàn)證P53與NOD8啟動(dòng)子的結(jié)合 將HEK293 細(xì)胞以3×106cells/well加入6孔板，轉(zhuǎn)染pNOD8(760)-EGFP質(zhì)粒48 h后，1% 甲醛處理細(xì)胞10 min ，用Millipore ChIP Kit 分析P53與NOD8啟動(dòng)子間的相互作用(按說明書操作)。P53抗體為山羊抗性(Santa Cruz Biotechnology) ；從蛋白-DNA復(fù)合物中分離得到的DNA片段被純化并進(jìn)行PCR分析，同時(shí)以基因組基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增GAPDH作為陽性對(duì)照，并以在相同條件處理，用小鼠IgG抗體進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)所得的基因片段作為陰性對(duì)照模板。NOD8上游引物5’-CCATC CGTCTAAGGAGGCATACAG-3’，下游引物5’-GCAAAGCTCCAAGAAAG ACAAG-3’， 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度250 bp；GAPDH 上游引物5’-AGCACCCCTGGCCAAGGTCA -3’，下游引物5’-CAATGCCAGCCCCAGCGTCA-3’， 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度454 bp。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s ，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在含0.5 mg/L溴化乙啶(EB)的10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳分析，用紫外觀測(cè)儀觀察結(jié)果。

2.3PCR擴(kuò)增NOD8基因及回收 根據(jù)GenBank提供的NOD8基因組序列(序列號(hào)NM_176821)和所選用的質(zhì)粒pEGFP-C2設(shè)計(jì)合成1對(duì)引物。所擴(kuò)增的片段大小為1 968 bp；引物由上海生工合成。上游引物為5’ - CCGCTCGAGCCTTCCCCCAGATCACCAT - 3’，下游引物為5’- CGGGGTACCATATGTAAGTATTTTTTGGTGTTT - 3’。在上游引物和下游引物的5′端分別引入XhoI和KpnI 的酶切位點(diǎn)(下劃線序列) 。以人基因組DNA為模板, PCR擴(kuò)增出相應(yīng)片段，反應(yīng)體系如下：模版1 μL、10 ×PCR緩沖液2 μL、引物(10 mol/L ) 各 1 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL及10 mmol/L dNTP 2 μL, 加H2O至50 μL混勻。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s ，72 ℃ 2 min ，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在含0.5mg/L溴化乙啶的10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳分析，用紫外觀測(cè)儀觀察結(jié)果后，用Omega Agarose Gel DNA Purification Kit膠回收試劑盒切膠回收目的DNA片段(按說明書操作)。

2.4重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定 限制性內(nèi)切酶XhoI 和KpnI 雙酶切帶有酶切位點(diǎn)的目的NOD8基因片段及pNOD8(760 bp)-EGFP、mpNOD8(750 bp)-EGFP質(zhì)粒，用10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，切膠回收NOD8片段和線性化的pNOD8- EGFP、mpNOD8(750 bp)-EGFP, 在T4 DNA連接酶作用下16 ℃連接過夜。以Mandel等[9]提出的氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)菌，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將轉(zhuǎn)化的菌液涂布于含卡那霉素的LB平板上,37 ℃培養(yǎng)16 h ,挑取陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒, 進(jìn)行XhoI和KpnI雙酶切鑒定和PCR鑒定。經(jīng)上述方法鑒定后的pNOD8(760 bp)- EGFP-NOD8和mpNOD8 (750 bp)-EGFP-NOD8重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列分析，由大連TaKaRa公司測(cè)序,序列確證無誤后，再大量擴(kuò)增。

2.5細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染 采用DMEM培養(yǎng)液，按總?cè)芤后w積的10%添加胎牛血清及青霉素和鏈霉素各100 mg/L，在37 ℃、5%CO2條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d 將HEK293細(xì)胞按5×108/L的密度分別接種于6孔板內(nèi),所有實(shí)驗(yàn)組待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將2 μg質(zhì)粒DNA稀釋于150 mmol/L NaCl至終體積150 μL, 取4 μL JetPeiTM，用150 μL 150 mmol/L NaCl稀釋并混勻。隨后，制備JetPeiTM/DNA復(fù)合物，將150 μL JetPeiTM溶液加入150 μL DNA溶液中。室溫下孵育20 min；將JetPeiTM/DNA復(fù)合物加入12孔板，輕輕混勻，置于CO2培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中孵育。48 h后用含800 mg/L G418 (Sigma)DMEM培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選，10 d 后改用400 mg/L G418 DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)3～4 d，直至細(xì)胞融合。

2.6四甲基偶氮唑鹽法(MTT)檢測(cè) 將HEK293細(xì)胞以1×104cells/well 鋪于96孔板，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，并設(shè)與實(shí)驗(yàn)平行的本底對(duì)照孔。細(xì)胞長(zhǎng)滿78%～80%后加入不同濃度的PFT-α，孵育48 h后，每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，棄孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)595 nm的吸光度值。細(xì)胞存活率=(加藥組A值-不加細(xì)胞組A值)/(對(duì)照組A值-不加細(xì)胞組A值)×100%。

2.7檢測(cè)PFT-α 對(duì)NOD8 mRNA表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)分組：在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48 h后，分為(1)pEGFP- C2轉(zhuǎn)染組(對(duì)照組)；(2)pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組；(3)mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組；(4)加入不同濃度的PFT-α (P53 抑制劑)的pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組，PFT-α 在轉(zhuǎn)染前5 h以 20、 60、 90 μmol/ L 加入培養(yǎng)板中,然后處理同其它組轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后3 h, 將細(xì)胞用PBS洗2次，用含有PFT-α的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞。收集上述處理組中的HEK293細(xì)胞以PBS洗滌后，加入500 μL/well Trizol裂解液，按說明書提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄：取0.5 μg細(xì)胞總RNA，加入0.5 μL逆轉(zhuǎn)錄酶, 按說明書合成cDNA。上游引物5’-CCATCCGTCTAAGGAGGC -3’ ，下游引物5’- GCAAAGCTCCAAGAAAG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為229 bp ;并設(shè)計(jì)GAPDH引物為內(nèi)參對(duì)照，上游引物5’-AGCACCCCTGGCCAAGGTCA -3’，下游引物5’- CAATGCCAGCCCCAGCGTCA-3’。PCR反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件： 95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s ， 30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。 擴(kuò)增出的NOD8片段，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行觀察其與預(yù)期DNA片段大小是否一致，并進(jìn)行半定量灰度值分析：

NOD8 mRNA相對(duì)量=(NOD8灰度值/GAPDH灰度值)/(control組NOD8灰度值/control組GAPDH灰度值)×100%。

2.8Western blotting分析NOD8蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組：(1)pEGFP-C2轉(zhuǎn)染組；(2)pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組；(3)mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組；(4)加入90 μmol/L PFT-α的pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組。收集各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次后, 加入細(xì)胞裂解液50 μL, 冰浴30 min, 12 000 r /min離心 15 min, 取上清加入等體積的 5×SDS上樣緩沖液煮沸5 min。以 15 μL /well加樣經(jīng)50 g/L積層膠后進(jìn)行120 g/L分離膠 SDS-PAGE電泳, 常規(guī)方法在Bio-Rad系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上, 50 g/L脫脂奶粉封閉過夜; 第2 d TBST洗膜后,加入抗NOD8單克隆抗體 (mAb) (1 g/L) (1∶500)置搖床室溫溫育 2 h, 洗滌30 min后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG(1∶2 000)為Ⅱ抗, 同上反應(yīng); 再次洗滌3次,每次10 min,然后用 ECL化學(xué)發(fā)光顯影, GAPDH作為內(nèi)參照。NOD8 蛋白相對(duì)量=(NOD8灰度值/GAPDH灰度值)/(control組NOD8灰度值/control組GAPDH灰度值)×100%。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果

HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pNOD8(760 bp)-EGFP質(zhì)粒48 h后，經(jīng)ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)P53能夠結(jié)合到NOD8基因啟動(dòng)子上。與P53抗體結(jié)合的DNA片段經(jīng)PCR反應(yīng)可見大量NOD8啟動(dòng)子擴(kuò)增片段，片段長(zhǎng)度為250 bp；小鼠IgG陰性對(duì)照組經(jīng)PCR反應(yīng)后未見特異性擴(kuò)增片段，而在以全基因組片段為模板的GAPDH組中，可見大小約為454 bp大小的片段，但在與P53抗體結(jié)合的基因片段為模板的PCR反應(yīng)中未擴(kuò)增出特異性條帶，證實(shí)免疫共沉淀成功，見圖1。

Figure 1. Binding of P53 to the NOD8 promoter was validated by ChIP. Before immunoprecipitation, an aliquot of each sample was served as an ‘input’ fraction (PCR control).

2NOD8基因DNA片段的PCR擴(kuò)增

瓊脂糖凝膠電泳顯示, 擴(kuò)增基因片段的大小分別為1 968 bp，結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)一致，見圖2A。

3重組表達(dá)載體鑒定

將構(gòu)建的2個(gè)重組質(zhì)粒pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8和mpNOD8(750 bp)- EGFP-NOD8用XhoI 和KpnI雙酶切,分別獲得大小為1 968 bp的基因片段，見圖2B，表明人NOD8基因序列已被插入到pEGFP-C2中，并且P53結(jié)合位點(diǎn)缺失突變成功。重組質(zhì)粒由TaKaRa公司進(jìn)行序列檢測(cè),測(cè)定結(jié)果聯(lián)網(wǎng)到NCBI進(jìn)行同源性分析, 同源性為100%。測(cè)序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫相應(yīng)的NOD8基因DNA 序列完全一致，表明含有/缺失人P53結(jié)合位點(diǎn)的NOD8基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的、表達(dá)綠色熒光蛋白-NOD8融合蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Figure 2. Identification of NOD8 gene recombinant plasmids. A: the NOD8 gene fragments obtained from PCR were separated by 1% agarose electrophoresis. Lane1: marker; Lane 2: the NOD8 gene fragment. B: identification of recombinant plasmids digested with Xho I and Kpn I restriction enzymes. Lane1: pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8; Lane2 :mpNOD8(750 bp)- EGFP-NOD8; Lane 3: marker.

4PFT-α對(duì)HEK293細(xì)胞活性的影響

不同濃度的PFT-α處理HEK293細(xì)胞48 h后，細(xì)胞活性不受影響，見圖3，與空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。因此本實(shí)驗(yàn)選取20、60、90 μmol/L 3個(gè)劑量作為后續(xù)研究中的給藥濃度。

Figure 3. Effect of PFT-α on HEK293 viability.

5轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞NOD8mRNA的表達(dá)

RT-PCR 結(jié)果顯示，所有待分析樣本的 cDNA均擴(kuò)增出強(qiáng)度基本一致的GAPDH,表明 cDNA質(zhì)量穩(wěn)定,可用于靶基因的表達(dá)分析。采用上述特異性引物可擴(kuò)增出大約229 bp的目的基因片段和454 bp的內(nèi)參基因片段，見圖4A。pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組NOD8 mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照pEGFP-C2轉(zhuǎn)染組，是其(138.4±6.4)%；而NOD8 mRNA在mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8組中的表達(dá)最低為對(duì)照組的(49.2±3.5)%，并且顯著低于b組(Plt;0.01)，見圖4B。

Figure 4. Relative NOD8 mRNA level after transfection and treatment with PFT-α . A: expression of NOD8 mRNA by 1%agarose gel electrophoresis;B: quantitation of NOD8 mRNA expression in HEK293 cells. a: pEGFP-C2; b: pNOD8(760 bp)- EGFP-NOD8; c: mpNOD8(750 bp)- EGFP-NOD8; d～f: pNOD8(760 bp)- EGFP-NOD8 and treated with PFT-α (20, 60, 90 μmol/L),respectively±s.n=3.*Plt;0.05,**Plt;0.01 vs b group.

6PFT-α對(duì)NOD8mRNA表達(dá)的影響

加入P53抑制劑PFT-α的pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8 轉(zhuǎn)染組中NOD8 mRNA表達(dá)顯著下降，且與PFT-α 呈劑量依賴關(guān)系，其中以90 μmol/L PFT-α 對(duì)NOD8 mRNA表達(dá)的抑制作用最為顯著，見圖4B，為a組的(72.5±2.6)%。這些結(jié)果表明NOD8啟動(dòng)子中P53結(jié)合位點(diǎn)具有上調(diào)NOD8基因的作用。

7NOD8蛋白在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

為進(jìn)一步研究P53 結(jié)合位點(diǎn)對(duì)NOD8的調(diào)控作用，我們用Western bloting 檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組[pEGFP-C2、pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8、mpNOD8(750 bp)- EGFP-NOD8和PFT-α處理的pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8]中NOD8蛋白的表達(dá)，見圖5A。NOD8蛋白在 pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8 轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組pEGFP-C2；與mRNA檢測(cè)結(jié)果一致的是，突變質(zhì)粒mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8和PFT-α處理的pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8)轉(zhuǎn)染組NOD8蛋白的表達(dá)明顯低于pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組，分別為其(31.2±4.9)%和(50.5±3.4)%,Plt;0.01,見圖5?；谝陨辖Y(jié)果推測(cè)，P53可與NOD8基因啟動(dòng)子上的P53結(jié)合位點(diǎn)相互作用，并上調(diào)NOD8蛋白的表達(dá)。

Figure 5. NOD8 protein expression detected by Western blotting analysis. a:pEGFP-C2; b: pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8; c: mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8; d: pNOD8(760 bp)-EGFP- NOD8 treatment with 90 μmol/L PFT-α.±s.n=4.*Plt;0.05 vs a group;##Plt;0.01 vs b group.

討 論

NLRs 廣泛存在于植物、線蟲、脊椎動(dòng)物和人類的胞漿內(nèi),在遺傳上高度保守，參與對(duì)細(xì)菌的識(shí)別及誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。NOD8基因位于16q12，編碼NOD8蛋白，它的mRNA可表達(dá)于各種組織中。近年來發(fā)現(xiàn)，NOD8可與ASC相互作用并抑制ASC的多種功能，包括對(duì)NF-κB和caspase-1的激活,以及誘導(dǎo)凋亡。NOD8還可以與 caspase-1和 IL-1β 相互作用并能抑制caspase-1介導(dǎo)IL-1β的成熟。因此，NOD8可能是一個(gè)炎癥與凋亡的多功能負(fù)調(diào)節(jié)因子[7]。NOD8在腦、心臟和肌肉高表達(dá)，而ASC在這些組織中的表達(dá)恰好相對(duì)較低，因此NOD8可能在ASC介導(dǎo)的炎癥或凋亡中起著保護(hù)作用[10]。

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起著重要作用，它可以與啟動(dòng)子中特殊的DNA序列直接結(jié)合從而發(fā)揮促進(jìn)或抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用。在本研究中，我們運(yùn)用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)在人與黑猩猩的NOD8基因核心啟動(dòng)子區(qū)域相似位置含有P53結(jié)合位點(diǎn)；另一方面，在小鼠與大鼠的啟動(dòng)子區(qū)域沒有P53結(jié)合位點(diǎn)。因此我們認(rèn)為在人與黑猩猩的NOD8基因調(diào)控中有著高度相似的機(jī)制。這種假設(shè)被研究人與黑猩猩之間全基因組調(diào)控進(jìn)化論所支持[11]。我們認(rèn)為該結(jié)合位點(diǎn)在NOD8基因的調(diào)控中扮演了重要的作用 。

我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在靜息細(xì)胞中，含有P53結(jié)合位點(diǎn)的NOD8啟動(dòng)子重組質(zhì)粒能驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白表達(dá)，但熒光強(qiáng)度較陽性對(duì)照pEGFP-C2組低，說明NOD8基因啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-710 bp ～ -50 bp處已包含了需要起始轉(zhuǎn)錄的基本轉(zhuǎn)錄元件；而缺失P53結(jié)合位點(diǎn)的突變質(zhì)粒mpNOD8-EGFP和加入PFT-α后的重組質(zhì)粒pNOD8-EGFP綠色熒光蛋白表達(dá)顯著減弱。說明P53結(jié)合位點(diǎn)在NOD8基因調(diào)控中發(fā)揮了正調(diào)節(jié)作用[8]。

為進(jìn)一步研究 P53 結(jié)合位點(diǎn)對(duì)NOD8基因的調(diào)控作用，我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過ChIP方法證實(shí)了P53可以與NOD8啟動(dòng)子結(jié)合；同時(shí)構(gòu)建了pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8和mpNOD8(750bp)-EGFP-NOD8重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組(NOD8啟動(dòng)子中的P53結(jié)合位點(diǎn)被缺失突變) NOD8 mRNA的表達(dá)顯著低于pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組(NOD8啟動(dòng)子中包含P53結(jié)合位點(diǎn))；并且加入P53抑制劑PFT-α的pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組NOD8 mRNA的表達(dá)也明顯降低。此外，在mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組或轉(zhuǎn)染pNOD8(760 bp)- EGFP-NOD8質(zhì)粒并加入P53抑制劑的細(xì)胞中NOD8蛋白表達(dá)也顯著低于pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8轉(zhuǎn)染組。這些結(jié)果說明，P53可以與NOD8基因啟動(dòng)子上的P53結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，并且上調(diào)NOD8的表達(dá)，P53結(jié)合位點(diǎn)在NOD8基因調(diào)控中發(fā)揮了正調(diào)節(jié)作用。這種正性反饋調(diào)節(jié)可能在病原體入侵機(jī)體時(shí)發(fā)揮有效的抗炎作用，防止過度炎癥造成的自我損傷，這對(duì)進(jìn)一步了解天然免疫反應(yīng)具有重要意義。

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EffectofP53bindingsiteonregulationofhumanNOD8gene

ZENG Qi1, ZHANG Yun1, TIAN Li1, TANG Qing-liang1, HU Chao-feng1, BAI Zhi-quan2

(1DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicineofthePeople’sRepublicofChina,2DepartmentofPhysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:thcf@jnu.edu.cn)

AIM: To investigated the characterization and biological function of P53 binding element in the regulation ofNOD8 gene.METHODSUsing the method of bioinformatics, we found a completely preserved P53 binding site inNOD8 core promoter both in humans and chimpanzees.NOD8 gene was amplified by PCR from human cDNA and correctly connected into the vector pNOD8(760 bp)-EGFP-C2/ mpNOD8(750 bp)-EGFP-C2. The constructed plasmids pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8 and mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8 were transiently transfected into the cell line HEK293 by JetPeiTMand treated with pifithrin alpha (PFT-α，an inhibitor of P53) at different concentrations for 24 h. The mRNA and protein expression levels of NOD8 were detected by RT-PCR and Western blotting. In addition, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay was performed to determine the binding of P53 to theNOD8 promoter after recombinant plasmid pNOD8(760 bp)-EGFP was transfected into HEK293 cells.RESULTSThe plasmids pNOD8(760 bp) -EGFP-NOD8 and mpNOD8(750 bp)-EGFP-NOD8 were successfully constructed and conformed by restriction digestion and sequence analysis. The results of ChIP confirmed that P53 bound to the promoter ofNOD8. The mRNA expression of NOD8 in the cells transfected with pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8 was stronger than that in the cells transfected with control vector pEGFP-C2 (Plt;0.05). Furthermore, the mRNA expression of NOD8 was reduced in HEK293 cells transfectnt with the mutant plasmid mp NOD8 (750 bp)-EGFP-NOD8 compared with the cells transfected with pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8. Meanwhile, PFT-α inhibited the mRNA expression of NOD8 in the cells transfected with pNOD8(760 bp)-EGFP-NOD8 in a concentration-dependent manner, and PFT-α at concentration of 90 μmol/L was the most effective in inhibiting NOD8 mRNA expression (Plt;0.01). As expected, the protein expression of NOD8 inpNOD8 (760 bp)-EGFP-NOD8 group significantly increased compared with that inpNOD8-C2 group, the protein expression of NOD8 in mpNOD8 (750 bp)-EGFP-NOD8 group orpNOD8 (760 bp)-EGFP-NOD8 + PFT-α group was dramatically decreased compared with that in pNOD8(760 bp) -EGFP-NOD8 group.CONCLUSIONThe results suggest that the P53 binding site is critical for the regulation ofNOD8 gene and there is positive feedback regulation between P53 binding site andNOD8, which may maintain efficient balance between defense and self-inflicted injury in response to the invasion of pathogen.

Promoter; Genes,NOD8; P53 binding site; Nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptors

1000-4718(2011)12-2362-06

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.023

2011-11-09

2011-11-21

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No. 06025159);廣東省教育廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目[No. 126 (2005)];暨南大學(xué)“211工程”三期預(yù)研項(xiàng)目;暨南大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金資助項(xiàng)目

△ 通訊作者 Tel: 020-85228079; E-mail: thcf@jnu.edu.cn

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