駱駝蓬靈單獨和與洗必泰聯(lián)合對抗金黃色葡萄球菌懸浮菌和生物膜的抗菌活性研究

申鳳鴿 邢明勛 劉麗慧等

摘要：采用微量稀釋法測駱駝蓬靈和洗必泰（ＣＨＧ）單獨抗金黃色葡萄球菌懸浮菌和生物膜的最小抑菌濃度（ＭＩＣ）和最小殺菌濃度（ＭＢＣ）；棋盤稀釋法測定兩種藥物聯(lián)合時的協(xié)同效果；以及激光共聚焦采集圖片檢測部分聯(lián)合的效果。結果表明，駱駝蓬靈和ＣＨＧ聯(lián)合具有協(xié)同抗菌效果。在懸浮菌試驗中，９株顯示抗浮游菌協(xié)同活性，在生物膜試驗中，１１株顯示協(xié)同抗生物膜活性。其余菌株顯示相加活性，本試驗中無頡頏作用。初步探索了體外試驗協(xié)同作用的原因，為克服金黃色葡萄球菌耐藥提供了一個可供選擇的方法。

關鍵詞：駱駝蓬靈；洗必泰；協(xié)同作用；抗菌活性

中圖分類號：ＴＱ４６４．４文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）16－3346-05

Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Eｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｈａｒｍａｌｉｎｅ Aｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ Cｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Cｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ Dｉｇｌｕｃｏｎａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ Cｌｉｎｉｃａｌ Iｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Gｒｏｗｎ ｉｎ Pｌａｎｋｔｏｎｉｃ ａｎｄ Bｉｏｆｉｌｍ Cｕｌｔｕｒｅｓ

ＳＨＥＮ Ｆｅｎｇ－ｇｅ，ＸＩＮＧ Ｍｉｎｇ－ｘｕｎ，ＬＩＵ Ｌｉ－ｈｕｉ，ＹＵAN Ｐｅｎｇ，ＳＨＩ Ｑｉ－ｙｕｎ，ＹＵ Ｌｕ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｉｓ， Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００６２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ （ＭＩＣ） ａｎｄ ｍｉｎｉｍｕｍ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（ＭＢＣ） ｏｆ ｈａｒｍａｌｉｎｅ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ ｄｉｇｌｕｃｏｎａｔｅ （ＣＨＧ） ａｇａｉｎｓｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ or ｂｉｏｆｉｌｍ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ. Ｃｈｅｑｕｅｒｂｏａｒｄ ａｓｓａｙｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ， ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈａｒｍａｌｉｎｅ ａｎｄ ＣＨＧ； ａｎｄ ｓｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｈａｒｍａｌｉｎｅ ａｎｄ ＣＨＧ ｓｈｏｗｅｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｉｏｆｉｌｍ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｓ． ａｕｒｅｕｓ． Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈａｒｍａｌｉｎｅ ａｎｄ ＣＨＧ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ９ ａｎｄ １１ ｏｆ ｔｈｅ １３ Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｈｅｎ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｂｉｏｆｉｌｍ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｎｏ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ａｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｅｓｔｅｄ． Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈａｒｍａｌｉｎｅ ａｎｄ ＣＨＧ ａｇａｉｎｓｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｓ． ａｕｒｅｕｓ （ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｂｉｏｆｉｌｍ） ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｍｉｇｈｔ ｐｒｏｖｉｄｅ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ｂｏｔｈ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｆｉｌｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｈａｒｍａｌｉｎｅ； ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ ｄｉｇｌｕｃｏｎａｔｅ； ｓｙｎｅｒｇｙ； ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ

金黃色葡萄球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）是革蘭氏陽性菌，是一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬，能導致人體的局部和全身感染［１］，此外還能導致皮膚感染，食物中毒，關節(jié)炎，肺炎，腦膜炎，脊髓炎，心內膜炎和嚴重的并發(fā)癥［２］。

金黃色葡萄球菌能產生生物膜，生物膜能將細菌表面粘連在一起，形成復雜的生物群落，這種復雜的生物群落嵌入自身產生的多糖基質中，能抵抗環(huán)境和微生物的威脅［３］。據(jù)報道，微生物因子抗生物膜的最低抑菌濃度（ＭＩＣｓ）是懸浮菌的１０～１ ０００倍［４］。因此，急需開發(fā)新的藥物去治療金黃色葡萄球菌的生物膜感染。

洗必泰（ＣＨＧ）是一種很普遍的抗微生物因子，在臨床實踐中用于皮膚的消毒。洗必泰（ＣＨＧ）具有很寬的抗菌譜，可抗多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，如金黃色葡萄球菌［５］。盡管ＣＨＧ具有抗微生物活性，但是它的水和含醇制劑對皮膚的穿透力很弱，而細菌能在皮膚的深層存活［６］。因此，開發(fā)有效的和迅速穿透皮膚深層的消毒劑是很必要的，以預防侵入相關的皮膚感染［７］。

植物和其他的天然物質是新的抗微生物因子或協(xié)作劑的有效資源［８］。研究顯示其對耐藥的菌株有較寬的抗菌譜［９］。駱駝蓬靈是一種生物堿，是駱駝蓬（Peganum harmala）種子提取物的主要成分，很多體外研究顯示它具有抗菌活性［１０］。研究表明，這種生物堿具有抗細菌、抗腫瘤、抗血孢子蟲、抗癌、抗血管舒張和抗原蟲的作用［１１，１２］。目前尚未發(fā)現(xiàn)駱駝蓬靈對金黃色葡萄球菌懸浮菌和生物膜的活性影響的相關報道。

本試驗應用了微量稀釋法和棋盤法調查駱駝蓬靈單獨和與洗必泰聯(lián)合抗金黃色葡萄球菌的活性。

1材料和方法

1．１材料

甘果紅瓊脂：０．０８ ｇ甘果紅（Ｈｏｐｋｉｎｓ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｌｔｄ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ），５ ｇ蔗糖（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）和１ ｇ瓊脂粉（Ｏｘｏｉｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，ＵＫ）與９８ ｍＬ腦心浸液（Ｏｘｏｉｄ）混合制得，高壓滅菌，備用。Ｍｕｅｌｌｅｒ-Ｈｉｎｔｏｎ ａｇａｒ （ＭＨＡ） ａｎｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ-Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢ） （Ｏｘｏｉｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，ＵＫ）按說明書配制，高壓滅菌，備用。２０％的洗必泰（CHG）和駱駝蓬靈均購自美國 Ｓｉｇｍａ 公司。葡萄糖購自于Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。磷酸緩沖鹽水（ＰＢＳ）按說明書配置。９６孔、６孔板及玻片購自于Ｎｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｔｄ。

1．２菌株

１２株臨床分離株從吉林大學第一附屬醫(yī)院分離得到，ＡＴＣＣ ２９２１３購自于中國醫(yī)學微生物菌種保藏中心（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＣＭＣＣ）。細菌在ＭＨＢ或ＭＨＡ（Ｏｘｏｉｄ， Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ， ＵＫ）上３７ ℃培養(yǎng)。

1．３藥物準備

駱駝蓬靈用含０．１ ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４的去離子水配成２０ ４８０ μｇ／ｍＬ，-７０ ℃儲存。ＣＨＧ用ＭＨＢ稀釋成５１２ μｇ／ｍＬ，備用。

1．４細菌懸液的準備

菌株在ＭＨＡ板培養(yǎng)，３７ ℃過夜。挑單菌落與ＭＨＢ中搖床過夜，ＯＤ６６０nm ０．１（約１０８ ＣＦＵ／ｍＬ）。接種物在ＭＨＢ中稀釋，使菌液的濃度到１０６ ＣＦＵ／ｍＬ。

1．５懸浮菌的微量稀釋法藥物敏感試驗

ＣＨＧ和駱駝蓬靈的最低抑菌濃度（ＭＩＣ）通過倍比稀釋法按ＣＬＳＩ原則［１３］測得。在９６孔板中用ＭＨＢ將抗菌藥物做倍比稀釋，得到１００ μＬ的一系列藥液。每孔加入稀釋好的抗菌藥物１００ μＬ，每孔含菌１×１０５ＣＦＵ；只加培養(yǎng)基的為對照孔；將９６孔板置于３７ ℃培養(yǎng)２４ ｈ。肉眼未見細菌生長的最低藥物濃度即為該藥的最低抑菌濃度（ＭＩＣ）。所有抑菌的孔中取適量液體按原來的次序涂于ＭＨ瓊脂板上，３７ ℃培養(yǎng)２４ ｈ，肉眼未見細菌生長的最低藥物濃度為最小殺菌濃度（ＭＢＣ）。試驗重復３次。

1．６懸浮菌的棋盤測定試驗

ＣＨＧ與駱駝蓬靈間的協(xié)同作用是經微量棋盤測定法測定的［１４］。?。担?μＬ用ＭＨＢ倍比稀釋的駱駝蓬靈（１／３２×ＭＩＣ~４×ＭＩＣ）加于９６孔板的橫行，５０ μＬ ＣＨＧ的濃度梯度依次從１／２５６×ＭＩＣ到４×ＭＩＣ加于豎列。在孔中加入１００ μＬ濃度為１０６ ＣＦＵ／ｍＬ的菌液。第１２列作為對照，每孔分別加２００ μＬ ＭＨＢ或１００ μＬ １０６ＣＦＵ／ｍＬ 的菌液和１００ μＬ培養(yǎng)基。３７ ℃培養(yǎng)２４ ｈ。通過計算分級抑制濃度指數(shù)（ＦＩＣＩ）來評價藥物抗菌作用［１５］。ＦＩＣＩ＝（ＭＩＣａ聯(lián)合／ＭＩＣａ單藥）＋（ＭＩＣｂ聯(lián)合／ＭＩＣｂ單藥）。ＦＩＣＩ≤０．５為協(xié)同；ＦＩＣＩ＞４．０為頡頏；０．５＜ＦＩＣＩ≤４為相加。試驗重復２次。

1．７生物膜的建立

取能形成生物膜的菌株液２００ μＬ，濃度為１×１０５ ＣＦＵ／ｍＬ，加于９６孔板，３７ ℃培養(yǎng)４８ ｈ。

1．８生物膜的微量稀釋藥敏試驗

棄去形成生物膜的９６孔板中的懸液，用２５０ μＬ ＰＢＳ洗去懸浮的殘余菌液。用ＭＨＢ倍比稀釋的ＣＨＧ和駱駝蓬靈。２００ μＬ藥物稀釋液按順序加入各孔，對照孔只加PBS液200 μＬ。３７ ℃培養(yǎng)２４ ｈ。棄去懸液，用ＰＢＳ洗一次，加入２５０ μＬ ＰＢＳ，５０ Ｈｚ超聲波震蕩３０ ｍｉｎ，每孔的２５０ μＬ液體分別涂于ＭＨＡ上，制備生物膜［１６］，３７ ℃培養(yǎng)２４ ｈ。肉眼可見與對照孔菌量一樣或少于對照孔（加ＰＢＳ的孔）的最低藥物濃度為最小抑制膜生長的濃度（ＭＢＩＣ），未見細菌生長的最小藥物濃度為最小殺生物膜濃度（ＭＢＢＣ）。試驗重復３次。

1．９生物膜的棋盤測定試驗

形成生物膜后，按上述方法用ＰＢＳ洗１次，分別?。保埃?μＬ ＣＨＧ（１／２５６×ＭＩＣ~４×ＭＩＣ）和駱駝蓬靈（１／１６×ＭＩＣ~４×ＭＩＣ）稀釋液加于９６孔板中，ＣＨＧ加到豎列孔中，駱駝蓬靈加到橫行。３７ ℃培養(yǎng)２４ ｈ。棄去藥液后再用ＰＢＳ洗１次，用以前描述的方法得到生物膜，每孔２５０ μＬ涂到ＭＨＡ上，３７ ℃ ２４ ｈ培養(yǎng)后，評估ＦＩＣＩ值。

1．１０激光共聚焦（ＣＬＳＭ）

通過激光共聚焦攝像驗證ＣＨＧ和駱駝蓬靈單獨和聯(lián)合后的活性。２ ｍL菌液加于６孔板的含有滅菌玻片的各孔中，培養(yǎng)４８ ｈ，形成生物膜。玻片用ＰＢＳ洗一次，將玻片移入含受試條件的藥液中，培養(yǎng)２４ ｈ。然后用ＰＢＳ洗，用ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）的說明書進行染色。用 Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００激光共聚焦顯微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）ａ×６０ 物鏡采集圖像．。采用Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ｖｅｒｓｉｏｎ １．７．３．０．分析圖像和輸出圖像。

2結果

2．１ＣＨＧ和駱駝蓬靈對抗懸浮菌和生物膜的微量藥敏試驗

筆者對１２株臨床分離株和１株質控株ＡＴＣＣ ２９２１３進行了調查，ＣＨＧ和駱駝蓬靈單獨對抗金黃色葡萄球菌的懸浮菌和生物膜的活性，見表１。

2．２ＣＨＧ和駱駝蓬靈對抗懸浮菌和生物膜的棋盤試驗

在懸浮菌中ＣＨＧ聯(lián)合駱駝蓬靈的抗菌活性，見表２。結果顯示，在受試的懸浮菌中有９株具有協(xié)同作用，其ＦＩＣＩ值０．３７５～０．５００；４株有相加作用，其ＦＩＣＩ值０．750~１．500。

在對抗生物膜的試驗中，受試的１３株金黃色葡萄球菌中１１株具有協(xié)同活性，ＦＩＣＩ值為０．２５0~０．５０0。Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ３６２９和Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ３２１８顯示了相加的抗菌活性，其ＦＩＣＩ值分別是０．７５0和１．500（表３）。在所有試驗中均未出現(xiàn)頡頏作用。

2．３激光共聚焦試驗

通過激光共聚焦試驗評估ＣＨＧ和駱駝蓬靈單獨和聯(lián)合抗生物膜活性（圖１）。處理２４ ｈ后對照組可見大量的活菌生長（圖１－Ｅ），與對照相比，４×ＭＩＣ駱駝蓬靈處理后可見大量的細菌死亡，僅留部分菌在玻片上（圖１－Ｃ），４×ＭＩＣ ＣＨＧ處理后與之相似，可見大量的細菌死亡（圖１－Ａ）。用ＣＨＧ和駱駝蓬靈聯(lián)合處理后，圖片顯示出極強的殺菌效果，僅有少量的菌存活（圖１－Ｆ）。

４討論

在本研究中，我們用棋盤稀釋法初步分析了藥物－藥物相互作用。我們發(fā)現(xiàn)駱駝蓬靈抗金黃色葡萄球菌的活性較弱，但與ＣＨＧ聯(lián)合時具有較好的協(xié)同效果。據(jù)報道發(fā)現(xiàn)桉樹油和ＣＨＧ具有較好抗金黃色葡萄球菌生物膜活性［１７］，這與我們的結果一致。此外，有報道發(fā)現(xiàn)駱駝蓬靈具有毒性，但是其毒性很低［１８］。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)生物膜能增加了藥物的耐藥性［１９］。同時，ＣＨＧ和駱駝蓬靈對抗生物膜時有較高的ＭＢＣｓ值（≥５１２ μｇ／ｍL）。

在本研究中，駱駝蓬靈聯(lián)合ＣＨＧ抗受試的金黃色葡萄球菌的懸浮菌和生物膜均具協(xié)同效果。此外，在抗生物膜的試驗中，結果顯示二者聯(lián)合使用具有協(xié)同的作用，僅在Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ３６２９和Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ３２１８表現(xiàn)出相加的效果。重要的是，我們對棋盤稀釋法測得的結果用ＣＬＳＭ進行了進一步的證實。ＣＬＳＭ的圖像顯示駱駝蓬靈不僅能強有力地殺死細菌，而且也能很好地清除生物膜（圖１－Ｄ）。與之相似的是，高濃度的ＣＨＧ能有效地清除生物膜，但是它的殺菌作用較弱（圖１－Ｂ）。

在臨床中，ＣＨＧ廣泛被用于皮膚消毒。ＣＨＧ具有親水和疏水基因，研究表明生物膜的細胞外基質所帶的陰離子阻礙了ＣＨＧ陽離子的擴散，且能使細胞外基質的理化性質和三級結構改變［５］。二氫駱駝蓬堿和駱駝蓬靈是駱駝蓬種子提取物的主要生物堿，它用于控制自熱感染和實驗感染的牛血孢子蟲［２０］。也有研究表明駱駝蓬靈氨基氧化酶抑制子是一個Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換的弱的抑制子［２１］，它對ＮＨＥ（Ｎａ＋／Ｈ＋交換）亞型顯示出不同的親和力［２２］。我們發(fā)現(xiàn)駱駝蓬靈與ＣＨＧ聯(lián)合時在受試多數(shù)菌株中表現(xiàn)協(xié)同活性。此外，當駱駝蓬靈和ＣＨＧ聯(lián)合時能導致生物膜的結構破壞和細菌的死亡。駱駝蓬靈對抗金黃色葡萄球菌生物膜的機制目前尚不清楚。

綜上所述，盡管駱駝蓬靈單獨使用時的抗菌活性較弱，但與ＣＨＧ聯(lián)合對抗黃色葡萄球菌分離株和質控株ＡＴＣＣ ２９２１３有潛在協(xié)同活性。該發(fā)現(xiàn)具有一定的臨床價值。同時，對開發(fā)新型抗耐藥金黃色葡萄球菌藥物具有重要價值。

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［１２］ ＢＥＲＲＯＵＧＵＩ Ｈ， ＭＡＲＴＩＮ Ｃ，ＫＨＡＬＩＬ Ａ，et al． Ｖａｓｏｒｅｌａｘａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈａｒｍｉｎｅ ａｎｄ ｈａｒｍａｌｉｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｐｅｇａｎｕｍ ｈａｒｍａｌａ Ｌ． ｓｅｅｄｓ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒａｔ ａｏｒｔａ［Ｊ］． ＰｈａｒｍａｃｏｌＲｅｓ，２００６，５４（２）：１５０-１５７．

［１３］ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＣＬＳＩ）． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ ｇｒｏｗ ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ-ｅｉｇｈｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍ７－Ａ８［Ｍ］． ＵＳＡ：Ｗａｙｎｅ ＰＡ，２００９．

［１４］ ＳＨＩＮ Ｓ，ＬＩＭ Ｓ． Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｂａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｏｉｌｓ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐｐ［Ｊ］． Ｊ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００４，９７（６）：１２８９-１２９６．

［１５］ ＫＡＲＰＡＮＥＮ Ｔ Ｊ，ＷＯＲＴＨＩＮＧＴＯＮ Ｔ，ＨＥＮＤＲＹ Ｅ Ｒ，ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ ｄｉｇｌｕｃｏｎａｔｅ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｏｉｌ， ｔｅａ ｔｒｅｅ ｏｉｌ ａｎｄ ｔｈｙｍｏｌ ａｇａｉｎｓｔ ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｆｉｌｍ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， ２００８， ６２（５）：１０３１-１０３６．

［１６］ ＡＤＡＭＳ Ｄ，ＱＵＡＹＵＭ Ｍ，ＷＯＲＴＨＩＮＧＴＯＮ Ｔ，ｅｔ ａｌ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ２％ ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ ｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｉｎ ７０％ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｓｋｉｎ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔ［Ｊ］． Ｊ Ｈｏｓｐ Ｉｎｆｅｃｔ，２００５，６１（４）：２７８-２９０．

［１７］ ＨＥＮＤＲＹ Ｅ， ＷＯＲＴＨＩＮＧＴＯＮ Ｔ， ＣＯＮＷＡＹ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｏｉｌ ａｎｄ １，８－ｃｉｎｅｏｌｅ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ ｄｉｇｌｕｃｏｎａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｆｉｌｍ ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００９，６４（６）：１２１９-１２２５．

［１８］ ＤＩ Ｃ， ＤＥＬＭＡ Ｆ， ＯＬＬＩＶＩＥＲ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｔａ－ｃａｒｂｏｌｉｎｅ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｈａｒｍａｎｅ， ｈａｒｍｉｎｅ， ａｎｄ ｈａｒｍａｌｉｎｅ ｔｏｗａｒｄ ｐａｒａｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ［Ｊ］． Ｅｘｐ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ，２００４，１０６（３－４）：６７-７４．

［１９］ ＳＡＧＩＮＵＲ Ｒ， ＳＴDENIS Ｍ，ＦＥＲＲＩＳ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｂｉｏｆｉｌｍｓ ｆｒｏｍ ｉｍｐｌａｎｔ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００６，５０（１）：５５-６１．

［２０］ ＦＡＮ Ｂ， ＬＩＡＮＧＪ，ＭＥＮ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ａｌｋａｌｏｉｄ ｏｆ Ｐｅｇａｎｕｍｈａｒｍａｌａ Ｌ． ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｈａｅｍｏｓｐｏｒｉｄｉａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］． Ｔｒｏｐ Ａｎｉｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｄ，１９９７，２９（Ｓｕｐｐｌ． ４）：７７-８３．

［２１］ ＳＵＬＥＩＭＡＮ Ｍ Ｓ， ＲＥＥＶＥＳ Ｊ Ｐ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａ＋－Ｃａ２＋ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ ｈａｒｍａｌｉｎｅ［Ｊ］． Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃ，１９８７，８８（１）：１９７-２００．

［２２］ ＭＯＲＤＥＣＡＩ Ｐ，ＪＯＮＡＴＨＡＮ Ｗ． Ｓｏｄｉｕｍ／Ｃａｌｃｉｕｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ： ｉｔｓ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Pｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Rｅｖｉｅｗｓ，１９９９，

７９（３）：７６３－８５４．