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    一株海洋光合細(xì)菌D25的分離與鑒定

    2011-11-18 05:50:02劉天華李樂樂喬夢等
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2011年16期
    關(guān)鍵詞:生理生化海洋基因

    劉天華 李樂樂 喬夢等

    摘要:從威海近海采得的海洋沉積物中經(jīng)過富集培養(yǎng)和分離篩選,得到一株紫色菌落的海洋光合細(xì)菌,編號為D25。利用梅里埃公司細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對菌株的生理生化特征進(jìn)行了檢測,API 20E檢測結(jié)果共有ADH、CIT等4項(xiàng)檢測項(xiàng)目呈陽性,ONPG、LDC等16項(xiàng)檢測項(xiàng)目呈陰性。經(jīng)PCR反應(yīng)得到16S rRNA基因序列,16S rRNA基因序列測定和分析結(jié)果顯示該菌株為嗜硫小紅卵菌 (Rhodovulum sulfidophilum)。

    關(guān)鍵詞:海洋;光合細(xì)菌;16S rRNA基因;生理生化

    中圖分類號:Q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2011)16-3276-03

    Isolation and Identification of Photosynthetic Bacterium D25

    LIU Tian-hua,LI Le-le,QIAO Meng,XIE Fei

    (College of Marine Science, Shandong University at Weihai,Weihai 264209, Shandong, China)

    Abstract:A purple strain of marine photosynthetic bacteria numbered D25 was isolated from the marine sediments of WeiHai offshore through enrichment culture, isolation and screen. The physiological and biochemical characteristics of strain D25 were tested by New ATB, the results of API 20E test show that 4 items present positive such as ADH and CIT ,16 items present negative like ONPG and LDC. The 16S rRNA gene sequence were cloned by PCR technology,the results of testing and analyzing of 16S rRNA gene sequence identified the strain as Rhodovulum sulfidophilum.

    Key words: marine; photosynthetic bacteria; 16S rRNA gene; physiological and biochemical

    光合細(xì)菌(Photosynthetic bacteria,PSB),是一類在自然界中廣泛存在的,能在厭氧條件下進(jìn)行不放氧的光合作用并且能夠利用光能自養(yǎng)生長,具有復(fù)雜代謝功能的細(xì)菌的總稱。其具有固碳、固氮、脫氮、氧化硫化物等功能,是生命演化中的過渡類型,可作為光合作用機(jī)理和產(chǎn)氫固氮機(jī)理的研究材料[1-3]。由于光合細(xì)菌可以廣泛利用多種有機(jī)物,具有在不同的條件下進(jìn)行多種方式的生長代謝的特點(diǎn),使其在有機(jī)廢水處理中得以應(yīng)用,和傳統(tǒng)活性污泥法相比,利用光合細(xì)菌處理污水具有動力消耗低、脫氮除磷效果好、設(shè)備規(guī)模小、占地面積小、管理簡易等明顯優(yōu)勢[1]。此外,由于光合細(xì)菌具有凈化水質(zhì)和保護(hù)水環(huán)境的作用,加之其本身是活蛋白,營養(yǎng)豐富,在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面可以促進(jìn)生長,提高成活率和養(yǎng)殖效果,含有的抗病毒因子及多種免疫促進(jìn)因子可活化機(jī)體的免疫系統(tǒng),因此其在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面也得到了廣泛的應(yīng)用[4]。對海洋沉積物中的一株光合細(xì)菌D25進(jìn)行分離并對其生理生化特性進(jìn)行研究以及16SrRNA 基因序列的測定和分析,經(jīng)鑒定該菌株為Rhodovulum sp.的Rhodovulum sulfidophilum。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1海洋沉積物海洋沉積物由威海近海海域采得。

    1.1.2培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基:氯化銨1.0 g,乙酸鈉2.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,酵母膏0.2 g,蛋白胨0.2 g, EDTA 1.0 g,1 000 mL陳海水,pH值為7,滅菌后加入碳酸氫鈉1.0 g, 磷酸二氫鉀0.2 g。分離培養(yǎng)基:蛋白胨5.00 g,酵母粉1.00 g,檸檬酸鐵0.01 g,瓊脂18.00 g,陳海水1 000 mL,pH值為7。

    1.2方法

    1.2.1海洋光合細(xì)菌的富集取海洋沉積物約3 g,置于盛滿富集培養(yǎng)基的250 mL密閉富集培養(yǎng)瓶中,置于有恒定光源(25W白熾燈泡)的恒溫培養(yǎng)箱中在28 ℃條件下富集培養(yǎng)30 d,至培養(yǎng)液呈紅褐色時,富集結(jié)束。

    1.2.2海洋光合細(xì)菌的分離對富集得到的培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后采用涂布法轉(zhuǎn)接到分離培養(yǎng)基,恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。選取紫色單菌落進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化培養(yǎng),得到海洋光合細(xì)菌的純培養(yǎng)菌株D25。

    1.2.3生理生化特性檢測取一環(huán)分離純化得到的純培養(yǎng)菌株,通過劃線的方法轉(zhuǎn)接入分離培養(yǎng)基中28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。利用梅里埃公司細(xì)菌鑒定系統(tǒng)(API 20E鑒定試劑條)對菌株進(jìn)行生理生化特征的檢測與分析。

    1.2.416S rRNA基因序列測定和分析[5-8] 將菌株轉(zhuǎn)接入分離培養(yǎng)基中于恒定光源的恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)過夜。取一環(huán)單菌落懸浮于50 μL無菌去離子水中,100 ℃水浴加熱5 min,離心,取上清液作為PCR模板DNA。擴(kuò)增正向引物27F對應(yīng)于E. coil 16SrDNA序列的第8~27個堿基位置,反向引物1492R對應(yīng)于E. coli 16SrDNA的第1492~1510個堿基位置,其序列分別為5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′和5′-TACGG(C/T)TACCTTGTTA

    CGACTT-3′。102.10 μL PCR反應(yīng)體系組成為:1×PCR緩沖液,1.5mmol/L MgC12,4×dNTP混合物各200 μmol/L,引物各0.5 μmol/L,Taq DNA聚合酶

    1 μL(5 U/μL),2 μLDNA 原液。PCR反應(yīng)條件為:96 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,50 ℃復(fù)性1 min,72℃延伸2 min,30個循環(huán);最后72 ℃ 溫育7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,交由北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司進(jìn)行序列測定。

    向GenBank提交測得的基因序列,取得收錄號。通過NCBI網(wǎng)站選取相似程度較高的序列利用MEGA(4.1)軟件對其進(jìn)行序列比較及系統(tǒng)發(fā)育分析,確定其種屬及進(jìn)化位置。

    2結(jié)果與分析

    2.1海洋光合細(xì)菌的分離篩選結(jié)果

    通過富集培養(yǎng),30 d后觀察到富集培養(yǎng)液變?yōu)榧t褐色,將富集培養(yǎng)液稀釋,涂布于分離培養(yǎng)基,經(jīng)過培養(yǎng)后再次劃線分離得到1株純培養(yǎng)光合細(xì)菌,編號為D25。

    在分離培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h,可觀察到紫色、直徑0.5~0.8 mm圓形、表面隆起、邊緣整齊、不透明的菌落。經(jīng)革蘭氏染色鑒定其為革蘭氏陰性菌。

    2.2生理生化特性檢測

    利用梅里埃公司細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對菌株的生理生化特征進(jìn)行了檢測,API 20E檢測結(jié)果(表1)表明,共有ADH、CIT等4項(xiàng)檢測項(xiàng)目呈陽性,ONPG、LDC等16項(xiàng)檢測項(xiàng)目呈陰性。

    2.216Sr RNA基因序列測定與分析結(jié)果

    通過瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果顯示,得到的目的片段長度約為1 500 bp。將得到的目的片段交由北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司進(jìn)行序列測定,得到核苷酸序列(圖1)。向GenBank提交測得的基因序列,取得收錄號為HQ234299。通過NCBI網(wǎng)站選取相似程度較高的序列,利用MEGA(4.1)軟件對其進(jìn)行序列比較及系統(tǒng)發(fā)育分析,確定其種屬及進(jìn)化位置。該菌株為Rhodovulum sp.的嗜硫小紅卵菌(Rhodovulum sulfidophilum),是一類能產(chǎn)氫的光合細(xì)菌,由此構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。

    3小結(jié)與討論

    20世紀(jì)60年代日本科學(xué)家小林正泰等[9]發(fā)現(xiàn)光合細(xì)菌在不同營養(yǎng)級的微生物群生態(tài)演替的過程中起著十分重要的作用,而該過程是高濃度有機(jī)廢水在自然界得以自凈的原因所在。采用光合細(xì)菌處理污水不僅能夠降解簡單的有機(jī)化合物,而且還能夠降解較難處理的芳香化合物和鹵代化合物,因此光合細(xì)菌處理污水具有較大的推廣應(yīng)用價值[1]。隨著對光合細(xì)菌研究的深入,光合細(xì)菌作為一種具有特殊營養(yǎng)、促生長、抗病因子和高效率凈化養(yǎng)殖污水及對環(huán)境和水產(chǎn)動物無毒無害的特殊細(xì)菌[4],在水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域中被逐漸得到了應(yīng)用。

    試驗(yàn)從海洋沉積物中分離篩選得到了海洋光合細(xì)菌D25,通過PCR技術(shù)擴(kuò)增得到其16S rRNA基因序列,經(jīng)測序和比對,將其鑒定為Rhodovulum sp.的Rhodovulum sulfidophilum,由此構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定了其親緣進(jìn)化關(guān)系。嗜硫小紅卵菌是一種能利用還原性硫化物作為光合電子供體營光自養(yǎng)生長的嗜鹽紫色非硫細(xì)菌,這種代謝的方式對凈化海水、海產(chǎn)養(yǎng)殖地和高鹽含硫廢水的生物治理將具有重要意義。其菌體含有較為豐富的蛋白質(zhì)和色素,可作為魚類的開口飼料資源的重要來源,此外用其來培育輪蟲等多種餌料生物,其所含有的營養(yǎng)物質(zhì)可以通過食物鏈的關(guān)系間接供給水產(chǎn)養(yǎng)殖動物[10],因此菌株D25在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面也有著廣泛的利用價值。

    參考文獻(xiàn):

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