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    家蠶核型多角體病毒基因與抗病育種

    2011-11-18 05:50:02孫波周洪英吳宏麗
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2011年16期
    關(guān)鍵詞:育種家蠶抗性

    孫波 周洪英 吳宏麗

    摘要:家蠶(Bombyx mori L.)對家蠶核型多角體病毒(B. mori Nuclear polyhedrosis virus,BmNPV) 抗性為不完全顯性,在常染色體上由主效基因控制,在性染色體上有微效基因的協(xié)同作用??梗拢恚危校窒嚓P(guān)基因的研究,為生產(chǎn)上進(jìn)行防治提供了理論基礎(chǔ)。RNA干涉(RNA interference,RNAi)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因功能研究,為BmNPV抗性品種培育提供了新的方法。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷完善和應(yīng)用,在家蠶抗性品種輔助選育方面也取得了一定的成果,并且有獲得家蠶抗性新品種的報道。

    關(guān)鍵詞:家蠶;家蠶核型多角體病毒;抗性;基因;育種

    中圖分類號:S884.5+1;Q78;S882.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2011)16-3249-04

    Gene of Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus and Disease Resistance Breeding

    SUN Bo,ZHOU Hong-ying,WU Hong-li

    (Institute of Industrial Crops, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China)

    Abstract: The resistance of Bombyx mori to B. mori Nuclear polyhedrosis virus(BmNPV) was incomplete dominance,and was controlled by major gene on autosome and minor gene in sex chromosomes. The study on correlated gene of BmNPV enriched the theoretical foundation of disease prevention in production. The RNA interference technology was used extensively in research of gene function and provided a new method for breeding of BmNPV resistant variety. As the improving and application of molecular marker, some achievement in assisted selection of B. mori L. was obtained and some new BmNPV resistant varieties were reported.

    Key words: Bombyx mori L.; BmNPV; resistance; gene; breeding

    家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori L. Nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)是昆蟲病毒史上首先發(fā)現(xiàn)的病毒,屬于桿狀病毒科,包涵體亞科;它引起的家蠶核型多角體病毒病是養(yǎng)蠶業(yè)三大病毒病中危害最為嚴(yán)重的一種。該病在世界養(yǎng)蠶國家常呈暴發(fā)態(tài)勢,傳染性極強(qiáng),難以控制,危害最為嚴(yán)重,常造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。蠶業(yè)界多年來一直在尋找抗病基因,以闡明抗性機(jī)理、培育抗性品種,目前在很多領(lǐng)域已取得了一定的進(jìn)展。

    1傳統(tǒng)抗BmNPV品種選育

    家蠶遺傳學(xué)試驗表明,家蠶對BmNPV的抗性,無論是經(jīng)創(chuàng)傷感染或經(jīng)口感染,不同的品種存在著較大的差異[1]。家蠶對BmNPV抗性為不完全顯性,在常染色體上由主效基因控制,在性染色體上有微效基因的協(xié)同作用存在[2],但抗性主基因至今無法鑒定。

    傳統(tǒng)的抗BmNPV品種選育,多通過添毒試驗,獲得具有該病毒抗性基因的品系,然后通過基因轉(zhuǎn)育的方法獲得抗性品種;或者通過轉(zhuǎn)基因的方法獲得抗性品種。在選育抗BmNPV家蠶品種時,首先找到抗性很強(qiáng)的品種做親本材料,再將抗性導(dǎo)入經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良的家蠶品種中,同時必須實行多代連續(xù)經(jīng)口接種BmNPV以進(jìn)行個體和蛾區(qū)(系統(tǒng))選擇;配制雜交組合時,中國系統(tǒng)品種、日本系統(tǒng)品種兩方都應(yīng)有強(qiáng)抗性的親本,并且即使抗性品種(系統(tǒng))大體穩(wěn)定或育成,也還必須不斷地進(jìn)行BmNPV接種以強(qiáng)化抗性的選擇。作為生產(chǎn)用的抗性雜交組合,其母種一代有必要再進(jìn)行BmNPV接種的抗性選擇,以保持其抗性。

    朱勇等[3]以10個家蠶原種和2個家蠶雜交品種為材料,采用機(jī)率分析法研究了不同家蠶品種對BmNPV的抗性差異。結(jié)果表明,不同家蠶品種對BmNPV的抗性差異達(dá)到了極顯著水平??剐灾饕芪⑿Ф嗷蚩刂?,并具有偏父性遺傳現(xiàn)象,而且日本系統(tǒng)品種的抗性比中國系統(tǒng)品種強(qiáng);這與1963年易文仲的研究報道一致,錢荷英等的報道也證實了這一點(diǎn)[4],并且雜交F1代對BmNPV的抗性存在較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢。劉震等[5]對6個家蠶品種中腸消化酶活性與家蠶對BmNPV病毒抗性進(jìn)行了比較與分析,結(jié)果表明,中腸消化酶活性越強(qiáng)的抗性越強(qiáng),呈顯著的正相關(guān)關(guān)系,可以把家蠶對BmNPV抗性與中腸消化酶活性的關(guān)系應(yīng)用到家蠶抗性品種的選育中,把測定家蠶中腸消化酶活性作為選育和鑒定抗BmNPV病毒家蠶品種的一種輔助方法。

    2抗BmNPV相關(guān)基因研究進(jìn)展

    1999年美日科學(xué)家合作完成了BmNPV(T3株)的全基因組測序,共鑒定了136個開放閱讀框(ORF),其中包括了許多BmNPV繁殖的關(guān)鍵基因,如DNA解旋酶(DNA helicase)、DNA復(fù)制酶(DNA pol)、衣殼蛋白(Polyhedrin)等[6]。DNA解旋酶在病毒侵染家蠶的極早期表達(dá),而病毒的早期表達(dá)基因更容易受到宿主因子的影響[7]。BmNPV的DNAhel基因與舞毒蛾核型多角體病毒(Lymantria dispar L. Nuclear polyhedrosis virus,LdNPV)的hrf-1基因和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Actographa californica M. Nuclear polyhedrosis virus,AcNPV)的p147基因為同源基因,是病毒的宿主域因子。各種病毒重組試驗證明,只要擁有了對應(yīng)的宿主域因子,就可以在對應(yīng)的宿主中繁殖,反之則不能繁殖[8,9]。楊金宏等[10]根據(jù)GenBank公布的BmNPV(13株)序列,設(shè)計引物對其DNA解旋酶基因的核心結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了PCR擴(kuò)增,結(jié)果成功克隆了該基因,并利用雙酶切亞克隆構(gòu)建了酵母雙雜交誘餌載體PGBKT7。試驗證明重組誘餌載體不能自激活,可以作為誘餌進(jìn)行蛋白結(jié)合試驗,該研究為抗BmNPV的家蠶品種鑒定提供了依據(jù)。

    BmNPV的基因庫為L33180,這對于家蠶核型多角體病毒的研究有很大的幫助。其中P10基因啟動子控制BteryIA(b)截短基因,在AcNPV多角體基因上游ECOR V位點(diǎn)克隆構(gòu)建有包膜(OCU+)的重組病毒I,可以將AcNPV宿主域擴(kuò)展至家蠶等。P10基因是一個極晚期高表達(dá)的非必需結(jié)構(gòu)基因,用它取代OCU基因(多角體蛋白基因)構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體,將使重組病毒的包涵體外殼完整保留,適于作為基因工程病毒殺滅劑,具有較好的應(yīng)用前景。P10基因與多角體形態(tài)發(fā)生及多角體膜的形成有關(guān),可以為生產(chǎn)上進(jìn)行家蠶核型多角體病毒病的防治提供理論基礎(chǔ)。

    3利用RNAi技術(shù)抗BmNPV研究進(jìn)展

    1995年,Sui等[11]在研究線蟲parl基因功能時,首次發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA(dsRNA)能抑制特定基因的功能。1998年,Fire等[12]將dsRNA抑制特定基因表達(dá)的現(xiàn)象,正式命名為RNA干涉(RNA interference,RNAi),隨后在許多生物中都相繼發(fā)現(xiàn)存在RNAi現(xiàn)象。RNAi技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因功能研究,成為近年來發(fā)展應(yīng)用最迅速的分子生物學(xué)技術(shù),為家蠶核型多角體病毒抗性品種的培育提供了新的方法。

    2004年,Isobe等[13]第一次報道了利用RNAi技術(shù)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及家蠶對BmNPV的抗性。在以BmNPV重要的晚期表達(dá)因子lef-1為靶基因的RNAi試驗中,成功建立了表達(dá)lef-1雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因BmN細(xì)胞系,在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及家蠶中均抑制了BmNPV的增殖,但是并沒有降低感染病毒家蠶的死亡率。徐穎等[14]將體外轉(zhuǎn)錄的與DNA解旋酶基因和DNA聚合酶相對應(yīng)的dsRNA轉(zhuǎn)染到了家蠶培養(yǎng)細(xì)胞的BmN中,成功抑制了BmNPV的復(fù)制。夏定國等[15]以BmNPV復(fù)制必需的極早期基因ie-1和細(xì)胞釋放型病毒CRV入侵關(guān)鍵基因gp64為靶序列,分別人工設(shè)計并體外轉(zhuǎn)錄出dsRNA I1(438 bp)和dsRNA G1(337 bp),用家蠶培養(yǎng)細(xì)胞BmN研究目標(biāo)dsRNA對BmNPV復(fù)制、增殖的抑制效果。結(jié)果表明,dsRNA I1能有效地抑制BmNPV在BmN細(xì)胞中的增殖,最大抑制效果使培養(yǎng)液中的病毒滴度(TCID)比對照降低了104.30倍;dsRNA G1能顯著地抑制新形成的病毒粒子的細(xì)胞侵染能力,最高可使培養(yǎng)液中的病毒滴度降低103.17倍,這為進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行家蠶病毒病防治研究建立了技術(shù)基礎(chǔ)。gp64是細(xì)胞出芽型病毒的囊膜蛋白,對BmNPV的細(xì)胞間傳播起關(guān)鍵作用。如果抑制了gp64的表達(dá),理論上就可以抑制BmNPV的繁殖。夏定國等[16]在體外合成dsRNA試驗中,通過病毒滴度試驗、實時定量RT-PCR法研究了gp64基因的不同區(qū)域、不同長度與RNAi效果的關(guān)系,結(jié)果表明,供試的6個dsRNA的最大抑制效果相當(dāng)(滴度TCID50的最大抑制差值為4.00左右),經(jīng)RNAi不同時間點(diǎn)的gp64 mRNA表達(dá)水平均明顯出現(xiàn)了下調(diào)(P<0.01),其中48 h的gp64 mRNA的表達(dá)量約為對照的1/300。位于gp64 ORF的1390~1499位點(diǎn)(G3-3)是RNAi的較佳靶位點(diǎn),為進(jìn)一步構(gòu)建與基因序列互補(bǔ)的RNAi質(zhì)粒載體提供了依據(jù)。

    黃科等[17]將BmNPV的DNA聚合酶基因、蛋白激酶(PK1)基因以及bro-d和orf1629基因的部分編碼片段,分別以其反向重復(fù)的形式與家蠶Actin3啟動子連接,構(gòu)建了基于piggyBac轉(zhuǎn)座子載體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,通過顯微注射于家蠶卵中,獲得了36~107個G1蛾區(qū),得到了20~23頭轉(zhuǎn)基因陽性家蠶。經(jīng)Southern雜交及RT-PCR分析表明,BmNPV的4個反向重復(fù)片段都已經(jīng)導(dǎo)入了家蠶基因組中,并且可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。攻毒試驗結(jié)果表明,BmNPV的DNA聚合酶基因和PK1基因反向重復(fù)片段對病毒的增殖有抑制作用,從而使家蠶對BmNPV具有一定的抗性。而BmNPV的bro-d和orf1629基因反向重復(fù)片段對病毒的增殖沒有抑制作用。在培養(yǎng)細(xì)胞中,導(dǎo)入BmNPV的DNA polymerase、DNA helicase以及IEl、gp64、lef-1等基因的dsRNA,都使BmNPV的復(fù)制得到顯著的抑制。利用轉(zhuǎn)基因家蠶持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)與BmNPV的復(fù)制必需基因同源的dsRNA,有可能增強(qiáng)家蠶對BmNPV的抗性,進(jìn)而選育出高抗性的品種。

    RNAi技術(shù)是近幾年興起的一項更有效、更特異、更徹底的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù),利用RNAi技術(shù),破壞并抑制與病毒的宿主細(xì)胞識別蛋白、基因組復(fù)制因子、病毒結(jié)構(gòu)蛋白等相關(guān)基因mRNA的翻譯,是目前真核生物病毒病分子技術(shù)治療的一個最新策略。

    4從蛋白質(zhì)組水平上研究家蠶對BmNPV的抗性

    目前,家蠶抗BmNPV的研究主要是在致病機(jī)理、傳染途徑、DNA分子標(biāo)記和轉(zhuǎn)錄水平等方面,家蠶蛋白質(zhì)組水平研究還在剛起步階段。蔡克亞等[18]利用遺傳學(xué)原理,通過雜交和回交的方法,建立了家蠶抗BmNPV、感BmNPV以及近等基因系模型,利用2-D電泳和MALDI TOF/TOF MS質(zhì)譜技術(shù),從蛋白質(zhì)組水平上研究家蠶對BmNPV的抗性。結(jié)果獲得了家蠶高抗NB、高感306、近等基因系BC8五齡起家蠶血淋巴液蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜,分別獲得了180、190、187個蛋白點(diǎn),其中80%的蛋白點(diǎn)集中在等電點(diǎn)5~9范圍之內(nèi)。從3塊凝膠上共獲得明顯差異蛋白點(diǎn)l2個,由質(zhì)譜鑒定出5種蛋白,其中氨基?;福ǎ粒恚椋睿铮幔悖欤幔螅澹﹥H出現(xiàn)在抗性品系NB、近等基因系圖譜中,感性品系沒有出現(xiàn),初步推測是家蠶抗BmNPV特有蛋白,為首次報道。針對特定病毒基因的轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù),可使家蠶獲得對該病毒的抗性,因而有望成為今后家蠶抗病育種的新手段。

    5分子標(biāo)記輔助育種研究進(jìn)展

    遺傳標(biāo)記是基因組研究的重要內(nèi)容,是構(gòu)建物種遺傳圖譜的基礎(chǔ)。根據(jù)家蠶對BmNPV抗性遺傳規(guī)律的特殊性,陳克平等[2]提出了常染色體上NN主基因和性染色體上Z+Z+修飾基因的控制假設(shè),并得到試驗的驗證。利用近等基因系尋找抗性分子標(biāo)記,其交配方式不同,可分別構(gòu)建NN、Z+Z+、NNZ-Z+ 3種近等基因系,同時提出了F2群體尋找分子標(biāo)記的交配方式。目前,已有多項分子標(biāo)記技術(shù)用于家蠶基因組的研究,并構(gòu)建了幾種家蠶分子標(biāo)記遺傳圖譜。劉曉勇等[19]在含有抗核型多角體病毒病主效基因的家蠶品系NB和高感品系306及其近等基因系BC9中,采用500個RAPD隨機(jī)引物,分別在各個品系的DNA混合物中進(jìn)行擴(kuò)增以篩選分子標(biāo)記,獲得了與家蠶抗BmNPV病有關(guān)的3個分子標(biāo)記,它們分別是OPF-072023、OPJ-131300、OPM-161200。其中OPF-072023標(biāo)記通過各回交代檢測,證明獲得的標(biāo)記真實、可靠;又對該分子標(biāo)記的片段進(jìn)行克隆、測序;通過該片段的生物信息學(xué)分析,意外地在家蠶Z染色體上發(fā)現(xiàn)了一個逆轉(zhuǎn)位子的編碼序列,值得進(jìn)一步深入研究。

    近年來,隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷完善,已經(jīng)迅速地被應(yīng)用于動植物新品種的選育過程中;在家蠶抗性品種輔助選育方面也取得了一定的成果,并且有獲得抗性家蠶新品種的報道。姚勤等[20]對家蠶抗核型多角體病毒病以不同的雜交方式,構(gòu)建了3種近等基因系,用RAPD技術(shù)篩選出了抗病主基因連鎖分子標(biāo)記OPA-18700和感病連鎖分子標(biāo)記OPY-11400;同時在群體中驗證了抗性分子標(biāo)記的有效性[21],并利用我國家蠶種質(zhì)資源中發(fā)現(xiàn)的高抗BmNPV的品系NB和高感品系306,組配了近等基因系。采用RAPD技術(shù)獲得分子標(biāo)記,將標(biāo)記轉(zhuǎn)換成SCAR(Sequence characterized amplified region)標(biāo)記,利用SCAR標(biāo)記開展了家蠶抗性新品種的輔助育種選擇,獲得了家蠶抗BmNPV新品種。曹錦如等[22]利用分子標(biāo)記技術(shù)向家蠶實用品種中導(dǎo)入核型多角體病毒病抗性基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)已報道的分子標(biāo)記在不同品種間表現(xiàn)出差異,與抗性性狀并非完全相關(guān)。添毒結(jié)合標(biāo)記檢測,篩選出抗性品種多化N和敏感性的實用品種春華,將其作為育種素材,又從特定品種多化N中獲得了特異性連鎖片段。通過組配近等基因系,結(jié)合添毒試驗,在雜交組合BC3的F2代抗性個體中明顯檢測到了該標(biāo)記,初步表明該分子標(biāo)記具有一定的可靠性。

    6展望

    家蠶核型多角體病毒病危害嚴(yán)重,半個多世紀(jì)以來,人們對該病害的病原類型、侵染途徑、預(yù)防方法、家蠶品種抗性、遺傳規(guī)律,育種方法等諸多方面進(jìn)行了研究。目前在生產(chǎn)上,以防為主、綜合防治、培育對病原有較強(qiáng)抗性的家蠶新品種一直都是人們的努力方向。但是,由于家蠶對BmNPV的抗性為不完全顯性,既受常染色體上的主效基因控制,又受性染色體上的微效基因協(xié)同作用,加之環(huán)境因素的影響,使傳統(tǒng)的雜交育種方法難以育出實用性強(qiáng)的家蠶品種。

    近年來,現(xiàn)代生物技術(shù)飛速發(fā)展,為家蠶抗病育種提供了理論基礎(chǔ)和新的技術(shù)途徑,并且已經(jīng)有利用分子標(biāo)記技術(shù)培育出家蠶抗BmNPV新品種的報道。但是,由于受家蠶的抗性遺傳規(guī)律和品種選育的要求限制,在短時間內(nèi)還難以得到穩(wěn)定、優(yōu)良的抗性品種。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,相信在家蠶抗性品種培育方面會有更大的進(jìn)步。

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