棗莊地區(qū)雞群新城疫流行病學(xué)調(diào)查

張春嶺（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 泰安 271018 ②棗莊學(xué)院）

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棗莊地區(qū)雞群新城疫流行病學(xué)調(diào)查

張春嶺①②（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 泰安 271018 ②棗莊學(xué)院）

采用常規(guī)流行病學(xué)調(diào)查方法，對(duì)棗莊市6個(gè)地區(qū)13個(gè)肉雞群和13個(gè)蛋雞群的ND進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，13個(gè)疑似ND肉雞群的發(fā)病日齡一般在7~49日齡之間，發(fā)病率和死亡率分別為35%~90%和35%~68%；13個(gè)蛋雞群的發(fā)病日齡在70~480日齡之間，發(fā)病率、死亡率和產(chǎn)蛋下降率分別在10%~60%、3%~18.7%和10%~50%之間；不同品種的雞均可發(fā)生；肉雞以冬季多發(fā)，蛋雞以春、秋季多發(fā)。通過SPF雞胚接種和血凝試驗(yàn)(HA)、血凝抑制試驗(yàn)(HI)，從26個(gè)疑似雞ND的病雞群中分離到了20株NDV，其中12株為強(qiáng)毒株，5株為中等毒株，3株弱毒株。用分離的NDV株感染30日齡非免疫雞，發(fā)現(xiàn)發(fā)病率為100%，病死率在75%~100%之間，臨床癥狀、病理變化與自然發(fā)病雞相同。通過流行病學(xué)調(diào)查，初步探明了棗莊地區(qū)雞場(chǎng)發(fā)生ND的原因。

新城疫 雞群 流行病學(xué)調(diào)查 病毒分離

新城疫(Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒(Newcastle Disease Viruse，NDV）引起的雞的一種烈性傳染病，給禽業(yè)養(yǎng)殖帶了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，在我國(guó)雖然沒有大規(guī)模暴發(fā)ND，但不同地區(qū)的局部流行或散發(fā)時(shí)有發(fā)生。在長(zhǎng)期高強(qiáng)度的NDV疫苗免疫情況下，ND發(fā)病呈現(xiàn)特殊變化，主要是免疫失敗現(xiàn)象逐漸增多；感染宿主擴(kuò)大，對(duì)水禽致病力增強(qiáng)；NDV毒力發(fā)生了變異，無論人工傳代還是自然選擇，NDV的毒力均可能由弱變強(qiáng)，并且毒力的演化速度明顯在加快[1]，這無疑對(duì)傳統(tǒng)的ND免疫預(yù)防提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。本試驗(yàn)采用常規(guī)的流行病學(xué)調(diào)查方法，對(duì)棗莊市6區(qū)的主要養(yǎng)雞場(chǎng)的26個(gè)雞群(肉雞、蛋雞各半)的ND進(jìn)行了較系統(tǒng)的調(diào)查，基本摸清了該病在棗莊地區(qū)的流行狀況，并分離獲得了20株NDV；該研究結(jié)果為棗莊地區(qū)養(yǎng)雞場(chǎng)有效控制ND的發(fā)生流行提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采自棗莊5區(qū)(市中區(qū)、薛城區(qū)、嶧城區(qū)、臺(tái)兒莊區(qū)和山亭區(qū)）、1市(滕州市）的13個(gè)肉雞群和13個(gè)蛋雞群中患病或死亡的疑似ND病雞的腦、肝臟、肺臟、血液等樣品。

1.1.2 ND標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清 ND La Sota株標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清(HI效價(jià)為210），本研究室保存；禽流感(H9和H5）單因子標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清及EDS-76標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物研究所病毒室惠贈(zèng)。

1.1.3 雞胚與雞 10日齡SPF雞胚、1日齡SPF雞和SPF種蛋，均購(gòu)自山東省農(nóng)科院家禽研究所SPF雞研究中心；6周齡及30日齡非免疫雞，購(gòu)自棗莊某雞場(chǎng)。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 FA1104型電子天平(上海)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Forma公司）；CH20生物光學(xué)顯微鏡(Olympus Optical Co. Led. Japan）；SW-CJ-IF凈化工作臺(tái)(江蘇蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)公司）；96孔微量V型反應(yīng)板(艾本德中國(guó)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ND流行病學(xué)調(diào)查 采用常規(guī)流行病學(xué)調(diào)查方法，對(duì)棗莊市6個(gè)地區(qū)的26個(gè)疑似ND的病雞群的發(fā)病日齡、發(fā)病季節(jié)、發(fā)病率、死亡率及產(chǎn)蛋下降率等流行狀況進(jìn)行了調(diào)查，記錄、處理數(shù)據(jù)，并對(duì)發(fā)病原因進(jìn)行了分析。

1.2.2 病毒的分離 （1）病料的采集與處理。自棗莊市6個(gè)地區(qū)26個(gè)疑似雞ND的病雞群中無菌采集病、死雞的腦、肝臟、肺臟等樣品，每群隨機(jī)采30只，-20℃保存?zhèn)溆?；同時(shí)從每群尚無癥狀或發(fā)病不超2 d的雞中采集10份血樣，收集血清4℃保存?zhèn)溆肹2]。將上述病雞的腦、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟等組織剪碎、研磨后凍融3次，加5倍滅菌生理鹽水，混勻，加入雙抗(青霉素、鏈霉素)，使其終濃度達(dá)到2000IU/mL，4℃作用2h，取上清，5000r/min離心20min，取上清，用細(xì)菌濾器過濾，取過濾液-20℃保存?zhèn)溆?。?）雞胚接種。取上濾液，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚10枚，0.2ml/枚，同時(shí)取10枚接種滅菌生理鹽水作對(duì)照。石蠟封孔，37℃孵育，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚，以后每4h照蛋1次，及時(shí)收集死胚，4℃冷卻24h，無菌收集雞胚尿囊液，作細(xì)菌檢樣后放-20℃保存?zhèn)溆茫⒂^察雞胚的病理變化。

1.2.3 病毒的鑒定 （1）血凝試驗(yàn)(HA)：收集24h以后死亡雞胚及96 h內(nèi)活胚的尿囊液用微量法進(jìn)行血凝試驗(yàn)，即：先在96孔V型反應(yīng)板的橫排12個(gè)孔中各加入50μl生理鹽水，然后取50μl尿囊液于第一孔中混合，后吸出50μl至第2孔，依次倍比稀釋到第11孔，棄去50μl，12孔為生理鹽水對(duì)照孔。然后向每孔加1%雞的紅細(xì)胞50μl，振蕩1min，室溫作用30min，觀察并記錄結(jié)果。（2）血凝抑制試驗(yàn)(HI)：將上述具有凝集雞紅細(xì)胞能力的雞胚尿囊液按其HA效價(jià)配成4血凝單位分離毒；按微量法用NDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)。（3）禽流感、EDS-76陽(yáng)性血清中和試驗(yàn)：將結(jié)果為陽(yáng)性的雞胚尿囊液按HA效價(jià)配成4單位分離毒，再用禽流感(H9、H5)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、EDS-76標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清分別作HI試驗(yàn)。（4）新城疫病毒分離株的毒力測(cè)定：雞胚最小致死量平均死亡時(shí)間(MDT)測(cè)定：將檢測(cè)雞NDV為陽(yáng)性的尿囊液用滅菌生理鹽水作10倍遞增稀釋，每個(gè)稀釋濃度分別通過尿囊腔接種10日齡SPF雞胚6枚，0.lml/枚，37℃孵育7d，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚，以后每天照蛋4次，記錄每組中各胚死亡時(shí)間。取致全部雞胚死亡的尿囊液最高稀釋度對(duì)應(yīng)的死胚記錄，按中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程[3]計(jì)算MDT，計(jì)算公式：MDT=(x小時(shí)×x小時(shí)死亡雞胚數(shù)+y小時(shí)×y小時(shí)死亡雞胚數(shù)+z小時(shí)×z小時(shí)死亡雞胚數(shù)+…)/死亡雞胚總數(shù)。1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(ICPI)測(cè)定：將檢測(cè)雞NDV為陽(yáng)性的尿囊液用滅菌生理鹽水作10倍遞增稀釋，每個(gè)稀釋濃度分別腦內(nèi)接種l日齡SPF雛雞10只，0.05ml/只，取10只SPF雞注射滅菌生理鹽水作對(duì)照。試驗(yàn)組與對(duì)照組雞隔離飼養(yǎng)，觀察2次/d，連續(xù)觀察8d。觀察計(jì)分：正常雞得0分，患病雞得1分，死亡雞得2分。根據(jù)每日的記分，按下列公式計(jì)算ICPI[3]：ICPI=(8d累計(jì)發(fā)病數(shù)×l+8d累計(jì)死亡數(shù)×2)/8d內(nèi)累計(jì)觀察雞數(shù)。6周齡雞靜脈注射致病指數(shù)(IVPI)測(cè)定：將檢測(cè)NDV為陽(yáng)性樣品尿囊液用滅菌生理鹽水作10倍遞增稀釋，每個(gè)稀釋濃度分別翅靜脈接種6周齡非免疫雞10只，0.1ml/只，取10只雞注射同等劑量生理鹽水作對(duì)照。將試驗(yàn)組和對(duì)照組雞隔離飼養(yǎng)，觀察2次/d，連續(xù)觀察10d。觀察計(jì)分：正常得0分，發(fā)病雞得1分，癱瘓得2分，死亡得3分。根據(jù)得分按下列公式計(jì)算IVPI[3]：IVPI=(10d內(nèi)累計(jì)死亡數(shù)×3+10d內(nèi)累計(jì)癱瘓數(shù)×2+10d內(nèi)累計(jì)發(fā)病數(shù)×1)/10d內(nèi)累計(jì)觀察雞只總數(shù)。（5）NDV分離株人工感染試驗(yàn)：取30日齡ND非免疫雞210只，隨機(jī)分成21組，10只/組。將1~20組分別用分離的NDV液(分離株尿囊液作10倍稀釋)肌肉注射0.lml/只，第21組注射滅菌生理水作對(duì)照。嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)，每日觀察2次，連續(xù)觀察15d，并記錄雞的發(fā)病及死亡情況，及時(shí)無菌采集死亡雞的病料，用于病毒的回收試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 雞群流行病

對(duì)棗莊市6地區(qū)的疑似ND的13個(gè)肉雞群、13個(gè)蛋雞群的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果見表1、表2。

表1 棗莊市不同地域13個(gè)疑似ND肉雞群的發(fā)病情況

注：1：市中區(qū)；2：山亭區(qū)；3：臺(tái)兒莊；4：滕州市；5：薛城區(qū)；6：嶧城區(qū)

表2 棗莊市不同地域13個(gè)疑似ND蛋雞群的發(fā)病情況

從表1、2結(jié)果顯示，肉雞群的發(fā)病日齡一般在7~49日齡之間、蛋雞群在70~480日齡之間，其中7~10日齡的肉雞群發(fā)病率在35%~90%之間，死亡率在35%~68%左右；13個(gè)蛋雞群的發(fā)病率、死亡率和產(chǎn)蛋下降率分別在10%~60%、3%~18.7%和10%~50%之間；不同品種的雞均可發(fā)生；其中肉雞以冬季多發(fā)(6群/13個(gè)雞群)，蛋雞以春、秋季多發(fā)(5、5群/13個(gè)雞群)。

2.2 新城疫的發(fā)病原因分析

（1）發(fā)病雞場(chǎng)存在環(huán)境衛(wèi)生差、雞舍分布密集，舍與舍之間的距離太近的弊端。另外，雞舍簡(jiǎn)陋，消毒不徹底、沒有滅鼠和殺蟲意識(shí)、雞只飼養(yǎng)密度大、通風(fēng)不良、有害氣體濃度超標(biāo)等也是造成發(fā)病的重要原因。（2）發(fā)病雞場(chǎng)多是半封閉式飼養(yǎng)，很難預(yù)防其它雞群NDV強(qiáng)毒的傳入；養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)不同來源地雞并未分開飼養(yǎng)，造成不同疾病的混合感染。（3）管理人員缺乏獸醫(yī)知識(shí)，在飼養(yǎng)區(qū)剖解病死雞，對(duì)病死雞缺乏嚴(yán)格隔離和及時(shí)淘汰制度；對(duì)進(jìn)入養(yǎng)殖場(chǎng)的車輛和人員來往控制不嚴(yán)格；免疫程序不合理，具有隨意性；消毒制度不健全。

2.3 雞胚接種

雞胚接種后，28~64 h內(nèi)全部死亡，死亡胚體全身彌漫性出血，尤其是胚的頭部、頸部和腳爪出血嚴(yán)重，形成紫紅色出血斑，肝臟點(diǎn)狀出血斑和壞死灶。采集的尿囊液經(jīng)細(xì)菌檢驗(yàn)為無菌。

2.4 病毒鑒定

血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HI)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：26份被檢樣品中，有23份尿囊液對(duì)雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集(占樣品總數(shù)88.5 %)。23份中有20份被ND陽(yáng)性血清所抑制。但23份檢樣均不能被禽流感及EDS-76陽(yáng)性血清所抑制。

2.5 NDV分離株毒力

對(duì)分離的20株NDV分別進(jìn)行了MDT、ICPI和IVPI毒力指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 新城疫分離株毒力測(cè)定結(jié)果

由表3結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根據(jù)國(guó)內(nèi)比較公認(rèn)的毒力分類標(biāo)準(zhǔn)(MDT在30~60h之間、ICPI在1.6~2.0之間和IVPI在2.0~3.0之間為強(qiáng)毒株；MDT在60~90 h之間、ICPI在0.6~1.5之間和IVPI在<2.0為中等毒力株；MDT>90h、ICPI在0~0.5之間和IVPI在<2.0為弱毒株)。分離的20株NDV毒株，有12株強(qiáng)毒株，5株中等毒力，3株弱毒株。

2.6 NDV分離株人工感染

人工感染30日齡非免疫雞后，均有發(fā)病及死亡現(xiàn)象，發(fā)病率均為100%，死亡率為0%~100%不等，對(duì)照組雞未發(fā)病，全部健活。發(fā)病雞多數(shù)在第3~4d開始表現(xiàn)精神沉郁，羽毛蓬亂，喜臥，飲食欲下降，排黃綠色糞便，有呼吸道癥狀。第5~6d開始有死亡。剖解發(fā)現(xiàn)：病雞喉頭、氣管出血，腺胃乳頭充血，出血，十二指腸、空腸、回腸淋巴濾泡處黏膜腫脹、充血、出血或壞死潰瘍，盲腸扁桃體充血、出血、壞死。其它器官也有不同程度的出血。

3 討論

近年來，在養(yǎng)雞場(chǎng)中ND不斷發(fā)生流行，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的損失。為了探明棗莊市雞群ND的發(fā)生流行狀況，對(duì)棗莊地區(qū)26個(gè)雞群的ND進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，并從疑似雞ND的病雞群中，分離到了12株NDV強(qiáng)毒株，5株中等毒力株，3株弱毒株。

NDV可以通過飼養(yǎng)員、飼料、飲水、空氣灰塵和鳥類傳入，其中野鳥在ND的發(fā)生和流行中有不可忽視的作用[4]。本次流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病雞場(chǎng)多是半封閉式飼養(yǎng)，雞場(chǎng)消毒措施不健全，沒有滅鼠和殺蟲措施，對(duì)進(jìn)入養(yǎng)殖場(chǎng)的車輛和人員來往不加控制，野鳥尤其是麻雀在雞場(chǎng)、雞舍、飼料場(chǎng)穿梭頻繁。由此可見，作為與飼料廠、雞場(chǎng)接觸密切的麻雀等野鳥，在雞ND的傳播中發(fā)揮了重要作用，而防止野鳥尤其是麻雀、鴿子等對(duì)NDV的傳入是飼料廠、養(yǎng)雞場(chǎng)今后一項(xiàng)十分重要的任務(wù)。

由于疫苗接種的普及，ND的流行在我國(guó)一度得到控制，但目前仍有發(fā)生，陳美足[5]調(diào)查雞群免疫失敗時(shí)強(qiáng)調(diào)，疫苗質(zhì)量不佳、疫苗運(yùn)輸或保存不當(dāng)、疫苗稀釋液不符合要求、免疫接種時(shí)機(jī)不當(dāng)、接種劑量不準(zhǔn)確、接種方法不當(dāng)?shù)仁窃斐擅庖呤〉闹饕?。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，管理人員缺乏獸醫(yī)知識(shí)，對(duì)病死雞缺乏嚴(yán)格隔離和及時(shí)淘汰制度，免疫程序不合理，疫苗稀釋不符合要求等也是造成ND發(fā)生流行的重要原因。因此，提高養(yǎng)殖人員的獸醫(yī)基礎(chǔ)知識(shí)，購(gòu)買來源可靠的疫苗，掌握疫苗的正確使用方法，采取正確的接種方式是提高雞群免疫水平的重要因素。

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病雞場(chǎng)多半是農(nóng)戶中小型養(yǎng)雞場(chǎng)，雞群過分密集，致使一個(gè)雞群對(duì)ND的免疫措施不力，發(fā)生NDV感染，就會(huì)殃及周圍。雞舍的選址應(yīng)當(dāng)選擇地勢(shì)高燥，排水良好，且向陽(yáng)背風(fēng)的地方；水源水質(zhì)符合要求，要求未被傳染病污染過，透氣性和透水性良好，以保證場(chǎng)地干燥。另外，雞場(chǎng)一般距城市較遠(yuǎn)，但是要交通方便，既要與主要交通干線有一定的距離，又要能滿足禽場(chǎng)運(yùn)輸?shù)男枰?，保證雞場(chǎng)供水、供電。

綜上所述，ND疾病仍然是影響棗莊市禽類養(yǎng)殖的重大疾病，要想搞好禽類養(yǎng)殖就必須防控ND的發(fā)生流行；首先應(yīng)加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)的飼養(yǎng)管理水平，制定良好的生物安全措施；其次，還要提高養(yǎng)殖場(chǎng)工作人員的基礎(chǔ)獸醫(yī)知識(shí)，掌握疫苗免疫、獸藥應(yīng)用常識(shí)以及養(yǎng)殖知識(shí)；另外，還要建立良好的隔離消毒措施，這樣才能保證雞群的安全。

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（2011–02–02）

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1007-1733(2011)03-0040-03