小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞殺傷作用的研究

劉曉玲 宋振川 李 勇 肖建偉 郭宸君

DC的激活是機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)中的重要環(huán)節(jié)，DC在外周血中含量極少，分離純化困難。探究小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞制備的相關(guān)流程、添加GM-CSF、IL-4、TNF-α的劑量、時(shí)機(jī)、孵育時(shí)間，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志物以鑒定DC的成熟情況，探索提高DC的產(chǎn)量和純度的方法。采用(MTT)比色法測(cè)定DC對(duì)胃癌細(xì)胞的體外殺傷作用，探討樹突狀細(xì)胞腫瘤免疫機(jī)制，為臨床進(jìn)一步研究與應(yīng)用DC進(jìn)行胃癌的免疫治療提供佐證。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

胃癌細(xì)胞株:615小鼠前胃癌細(xì)胞株(MFC)購(gòu)于中科院上海細(xì)胞生物研究所，采用10%FBS-RPMI 1640培養(yǎng)液傳代。SPF級(jí)615小鼠，雌雄各半，鼠齡6～8周，體重17～21 g，購(gòu)于天津中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(津)2004-0001。所有小鼠購(gòu)回后飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

頸椎脫臼法處死615小鼠，浸入75%乙醇無(wú)菌取股骨，剝除肌肉，浸泡于PBS液中。剪開骨兩端，PBS液反復(fù)沖洗髓腔。骨髓細(xì)胞懸液400目濾網(wǎng)過(guò)濾。離心去上清，加入紅細(xì)胞裂解液吹打，加入PBS終止反應(yīng)，再離心清洗。細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，加GMCSF(終質(zhì)量濃度20 ng/ml)孵箱中培養(yǎng)。第3天吸去培養(yǎng)液及懸浮細(xì)胞，保留貼壁細(xì)胞，加入新鮮等量RMPI-1640全培養(yǎng)液和相同濃度的GM-CSF及終濃度為10 ng/ml的IL-4，隔日半量換液，補(bǔ)充RMPI-1640全培養(yǎng)液和GM-CSF及IL-4至第8天，加入TNF-α(10 ng/ml)，再培養(yǎng)48 h，收獲成熟的小鼠骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞。相差顯微鏡下，觀察六孔板中培養(yǎng)第1、3、5、7、8、10天樹突狀細(xì)胞的大小、形態(tài)、數(shù)量、分布、貼壁情況、細(xì)胞集落的生長(zhǎng)狀況，并拍照。

1.3 DC細(xì)胞表面標(biāo)志物的檢測(cè)

分別收集加入TNF-α前及加入TNF-α 48 h后的DC懸液，離心去上清。加入FITC anti-mouse CD11c、PE anti-mouse CD86單抗，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組DC表面CD11c、CD86的表達(dá)。

1.4 MTT法檢測(cè)樹突狀細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的體外殺傷活性

615小鼠胃癌細(xì)胞株MFC培養(yǎng)12 h，取培養(yǎng)第11天的DC，加入含有胃癌細(xì)胞的96孔板中 (10∶1、20∶1、30∶1)。另外單獨(dú)加入與效靶比同濃度的DC、胃癌細(xì)胞及1640培養(yǎng)液，每組5孔，設(shè)為對(duì)照組，共兩板。其一孵箱培養(yǎng)24 h，其二孵箱培養(yǎng)48 h，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)OD值，計(jì)算DC的殺傷活性。

2 結(jié)果

經(jīng)分離提純的小鼠骨髓細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，相差顯微鏡下可見(jiàn)到培養(yǎng)板底部有體積小、圓形、無(wú)明顯突起的半貼壁細(xì)胞，少量細(xì)胞集落形成;體外培養(yǎng)3天后貼壁細(xì)胞逐漸增多，松散黏附于培養(yǎng)板的細(xì)胞集落增多，散在少量DC，半貼壁，細(xì)胞體積較前有所增大，細(xì)胞核可見(jiàn)，呈小圓或橢圓形?？梢?jiàn)貼壁的單核巨噬細(xì)胞;體外培養(yǎng)第5天可見(jiàn)部分細(xì)胞脫壁，從細(xì)胞集落中釋放出來(lái)，呈半貼壁狀態(tài)，細(xì)胞體積變大，形狀不規(guī)則，呈星狀、蝌蚪狀、梭形，有部分突起，即為未成熟DC細(xì)胞;體外培養(yǎng)第7天，細(xì)胞體積較前一天增大，培養(yǎng)液中有更多懸浮細(xì)胞，細(xì)胞集落散在，形狀趨于星形，有2～5個(gè)不等的突起，有的較長(zhǎng)，但仍為梭形，其懸浮細(xì)胞為擴(kuò)增之骨髓樹突狀細(xì)胞。加入TNF-α 24 h后，大量形態(tài)典型的DC從集落釋放，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞體積增大，突起粗大且較長(zhǎng)，胞體相對(duì)飽滿，細(xì)胞形態(tài)呈星形、多邊形或梭形。每只615小鼠平均能分離出3×107個(gè)骨髓細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)可獲得約7×106個(gè)DC細(xì)胞。

將加入TNF-α前后組作為實(shí)驗(yàn)組，將未加抗體的DC作為對(duì)照組，DC表面標(biāo)志物CD11c陽(yáng)性表達(dá)率加入 TNF-α 前為(65.09 ±3.04)%，加入 TNF-α 后為(70.99 ±1.44)%(χ2=6.625;P=0.097);CD86 陽(yáng)性表達(dá)率加入 TNF-α 前為(25.80±0.30)%，加入 TNF-α 后為(55.91 ±2.41)%(χ2=6.856;P=0.032)，加入TNF-α前后CD86陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有顯著性，CD11c陽(yáng)性表達(dá)率加入 TNF-α前后無(wú)差別(P ＞0.05)。

DC與615小鼠胃癌細(xì)胞共孵育24 h，MTT法檢測(cè)，當(dāng)效靶比分別為10∶1、20∶1、30∶1時(shí)，DC對(duì)胃癌細(xì)胞的體外殺傷活性分別為(22.62±2.94)%、(45.75 ±1.48)%和(74.24 ±0.34)%，三組間比較差異有顯著性(χ2=13.997;P=0.036)。共孵育 48 h，DC對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性分別為:(28.32±3.27)%、(50.77 ±0.53)%和(79.90 ±2.65)%，三組間比較差異有顯著性(χ2=13.420;P=0.037)。孵育24 h與孵育48 h各等效靶比組間比較，DC對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性無(wú)明顯差別;對(duì)照組中DC對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。

3 討論

DC來(lái)源于骨髓CD34+細(xì)胞［1］。GM-CSF是維持DC發(fā)育及分化最根本的細(xì)胞因子［2］。研究表明用來(lái)誘導(dǎo)DC的GM-CSF濃度提高到20 ng/ml，同時(shí)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，可獲得更多DC(達(dá)1×108～3×108個(gè)/鼠，純度也達(dá)85%以上)，當(dāng)GM-CSF濃度大于20 ng/ml時(shí)，將會(huì)誘導(dǎo)出嗜酸性粒細(xì)胞集落的形成［3］，當(dāng)GMCSF的濃度達(dá)到40～80 ng/ml時(shí)，巨噬細(xì)胞集落和紅細(xì)胞集落將會(huì)大量增加?？梢?jiàn)在單獨(dú)使用GM-CSF誘導(dǎo)DC分化時(shí)濃度最佳點(diǎn)可能就是20 ng/ml。IL-4能抑制培養(yǎng)物中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生，并能使DC具有典型形態(tài)和很強(qiáng)的處理外源性抗原能力［4］。

小鼠骨髓來(lái)源的DC前體細(xì)胞，在細(xì)胞因子的催化下分化為非成熟DC，細(xì)胞表面較高表達(dá)與吸收和加工抗原有關(guān)的分子，如CD1A、CCR6。當(dāng)DC細(xì)胞完成抗原加工功能，向次級(jí)淋巴器官遷徙的過(guò)程中而成為成熟DC。成熟的DC表達(dá)高水平MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子、協(xié)同刺激分子(CD80、CD86)、黏附分子(CO40、CD44、CD54)、整合素及特征性標(biāo)記(CDla、CD1lc、CD83)等［5］。

樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)除了可以通過(guò)特異性腫瘤單克隆抗體(McAb)介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)，增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞的活性，激活并調(diào)控T淋巴細(xì)胞的免疫功能外，還有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性。

Shimamuraa等［6］發(fā)現(xiàn)髓系DC也可在體外直接殺傷纖維母細(xì)胞瘤MCA205。DC不分泌INF-r和TNF-α等殺傷因子，但分泌一氧化氮(NO)合成酶抑制劑可部分阻止瘤細(xì)胞的凋亡，因而認(rèn)為DC通過(guò)NO機(jī)制誘導(dǎo)瘤細(xì)胞的凋亡，并且不需要 DC-瘤細(xì)胞直接接觸。Yang等［7］研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者單核細(xì)胞來(lái)源的未成熟DC，可通過(guò)鈣依賴的Fas/FasL機(jī)制誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

DC直接殺傷腫瘤細(xì)胞的確切機(jī)制尚不十分清楚，目前已有的研究提示:DC與腫瘤作用后腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是DC殺傷腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要機(jī)制;DC直接殺傷活性除與其成熟度有關(guān)外，還與腫瘤細(xì)胞株的組織來(lái)源及刺激因子的種類有關(guān)［8］;Lu 等［9］報(bào)道 DC 表面的 TNF 家族中 TNFα、FasL和TRAIL均與DC的直接抗腫瘤活性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法，測(cè)定了小鼠成熟骨髓來(lái)源DC對(duì)小鼠胃癌細(xì)胞的體外殺傷作用。在混合培養(yǎng)24、48 h后，DC對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷作用隨效靶比的增大而增強(qiáng)，進(jìn)而證明了樹突狀細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用。共孵育24 h與48 h比較，DC對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性有增強(qiáng)趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異，為獲取最佳共孵育時(shí)間提供依據(jù)。

綜上所述，樹突狀細(xì)胞(DC)作為體內(nèi)專職抗原遞呈細(xì)胞，腫瘤抗原負(fù)載的DC回輸入體內(nèi)，能激發(fā)特異細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤能力。為了臨床研究的需要，從小鼠骨髓獲得大量DC十分必要。本研究經(jīng)提取小鼠骨髓細(xì)胞以GM-CSF聯(lián)合IL-4終末添加TNF-α培養(yǎng)，獲得了具有典型形態(tài)學(xué)特征及生物學(xué)特征的DC，建立了獲取大量小鼠骨髓成熟樹突狀細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法。MTT法顯示小鼠骨髓DC對(duì)胃癌細(xì)胞具有直接殺傷作用，本研究不僅為DC的體外培養(yǎng)提供了有效方法，而且為應(yīng)用DC對(duì)胃癌進(jìn)行免疫治療提供了證據(jù)。

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