(1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院綠色化工過(guò)程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北省新型反應(yīng)器與綠色工藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430074; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430070)
茯苓菌核多糖分離技術(shù)研究
張 凱1,李茂凡1,胡國(guó)元1*,嚴(yán)張微1,李友國(guó)2
(1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院綠色化工過(guò)程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北省新型反應(yīng)器與綠色工藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430074; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430070)
采用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)對(duì)熱水浸提法、微波法、酶法分離茯苓菌核多糖的工藝進(jìn)行探討.結(jié)果表明:熱水浸提法的最佳工藝條件為:料水比1:30(g/mL),浸提溫度70℃,浸提時(shí)間2 h,浸提2次;微波法最佳提取工藝條件為:料水比1:30(g/mL),功率296 W,時(shí)間4 min;酶法最佳提取工藝條件為:木瓜蛋白酶0.5%,初始p H 6,溫度60℃,時(shí)間2 h.酶法的多糖提取率最高.采用集成提取工藝的茯苓多糖提取率大幅度提高,酶法與微波組合法的多糖提取率最高.考慮到多糖得率、提取時(shí)間、提取成本等因素的影響,最優(yōu)的集成提取方式為酶法與微波組合法.
茯苓;菌核多糖;熱水浸提法;微波法;酶法
茯苓(Poria cocos)是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用真菌.茯苓的主要成分是β-茯苓聚糖.從茯苓中提取制備的茯苓多糖或茯苓異多糖具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、補(bǔ)體激活、抗誘變、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等生物活性.為此,從茯苓菌核中提取茯苓多糖的技術(shù)研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值.
目前,文獻(xiàn)報(bào)道的分離茯苓菌核多糖的方法有熱水浸提法、稀堿浸提法、酶法、微波、超聲波輔助提取法等[1-5].熱水浸提法的浸提時(shí)間長(zhǎng)且提取率較低,稀堿浸提法的浸提步驟繁瑣反應(yīng)劇烈,極易破壞茯苓多糖生物活性.酶法簡(jiǎn)化了多糖提取工藝,提取率大幅提高,但提取成本增加.微波法提取時(shí)間明顯縮短,既節(jié)能又高效,超聲波提取法無(wú)需加熱,可縮短提取時(shí)間,有較高的提取率,但微波法和超聲波提取法有設(shè)備要求.如何能將這些方法有效地結(jié)合起來(lái),將其集成創(chuàng)新,提出適宜規(guī)模化生產(chǎn)的茯苓多糖提取技術(shù),進(jìn)一步提高茯苓多糖的提取率是具有現(xiàn)實(shí)意義的.
1.1 材料、試劑和儀器
茯苓塊,湖北羅田產(chǎn),市場(chǎng)購(gòu)買.將茯苓塊置60℃烘烤2~3 h,粉碎過(guò)孔徑0.15 mm篩,收集粉末于棕色瓶中避光保存?zhèn)溆?
纖維素酶,上海伯奧生物科技有限公司,酶活大于15 U·mg-1;木瓜蛋白酶,Sigma公司,800 U·mg-1;葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、苯酚、濃硫酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?
BL-220H島津電子天平,島津國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司;722E可見(jiàn)光光度計(jì),天津市普瑞斯儀器有限公司;DK-S24型電熱恒溫水浴鍋,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;WP800 TL23-K3微波爐,Galanz;BCD-182B海爾電冰箱.
1.2 方法
1.2.1 多糖分離 a.熱水浸提法.據(jù)文獻(xiàn)[2-3]得到兩組不同熱水浸提工藝條件:第一組為料水比1:30、溫度70℃、熱水浸提2 h,浸提兩次,第二組為料水比1:70、溫度100℃、熱水浸提2.5 h,提取兩次.本文重復(fù)了這兩組提取工藝,結(jié)果表明兩組工藝條件的提取率相近,為此選取耗能少的第一組單因子試驗(yàn)結(jié)果來(lái)進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn),熱水浸提法正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1.
表1 熱水浸提法正交試驗(yàn)L9(33)因素與水平Table 1 Factors and Levels of orthogonal tests of hot water extraction method
b.微波法.采用文獻(xiàn)[4]及熱水浸提實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn),考察料水比、功率,微波處理時(shí)間對(duì)多糖提取效果的影響.微波法正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2.
表2 微波的正交試驗(yàn)L9(33)因素與水平Table 2 Factors and Levels of orthogonaltests of microwave method
表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Tablet 3 Results and analysis of orthogonal design tests
c.酶法.單酶法[5]采用0.5%的木瓜蛋白酶,最適宜p H為6,60℃提取2 h.復(fù)合酶法[6]采用木瓜蛋白酶與纖維素酶一起作用,其用量之比為2: 1,其中木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%,纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%,最適宜p H為4.5,45℃提取4 h.分別稱取1 g茯苓粉經(jīng)酶法處理后,抽濾,測(cè)定濾液中多糖的含量.
d.熱水浸提法、微波與酶法兩兩集成提取.首先用優(yōu)化的熱水浸提法進(jìn)行提取,水提完成后,抽濾,濾渣用優(yōu)化的微波條件進(jìn)行提取,最后抽濾,合并兩次得到濾液,進(jìn)行多糖含量的測(cè)定.然后通過(guò)調(diào)整提取順序,測(cè)定其他5個(gè)組合集成提取液的多糖含量.
e.熱水浸提法、微波與酶法集成提取.首先用優(yōu)化的熱水浸提法進(jìn)行提取,水提完成后,抽濾,濾渣用優(yōu)化的微波條件進(jìn)行提取,抽濾,濾渣用優(yōu)化的酶法進(jìn)行提取,最后抽濾,合并三次得到濾液,進(jìn)行多糖含量的測(cè)定.然后通過(guò)調(diào)整提取順序,測(cè)定其他5個(gè)組合集成提取液的多糖含量.
1.2.2 多糖的測(cè)定 多糖含量的測(cè)定采用苯酚—硫酸法[7].
2.1 熱水浸提法的正交試驗(yàn)
熱水浸提法正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3.
由表3可知,影響多糖含量的主次順序是A>C>B,即料水比>浸提溫度>浸提時(shí)間.根據(jù)各水平下K1、K2、K3確定各因素的最優(yōu)水平組合為A2B2C2,由此可見(jiàn),料水比對(duì)多糖含量影響最大,其次為浸提溫度和浸提時(shí)間.綜合考慮,采用熱水浸提法進(jìn)行多糖提取的最佳工藝條件為料水比1: 30,浸提溫度70℃,浸提時(shí)間2 h,浸提2次.本研究熱水浸提法的多糖提取率高于文獻(xiàn)[2-3]報(bào)道的結(jié)果.
2.2 微波法的正交試驗(yàn)
微波法的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表4.
表4 微波的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Tablet 4 Results and analysis of orthogonal design tests of microwave method
由表4可知,影響多糖含量的主次順序是C>B>A,即提取功率>浸提時(shí)間>料水比.根據(jù)各水平下K1、K1、K2確定各因素的最優(yōu)水平組合為A2B1C2,由此可見(jiàn),功率對(duì)多糖含量影響最大,其次為浸提時(shí)間和料水比.綜合考慮,采用微波進(jìn)行多糖提取的最佳工藝條件為料水比1:30,浸提時(shí)間4 min,提取功率為296 W.經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,微波最佳組合多糖提取量為11.436 mg·g-1符合正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果.本研究微波法處理的多糖提取率遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道的結(jié)果,分析可能與所用微波儀器不同以及參數(shù)設(shè)置不同有關(guān).
2.3 酶法提取多糖試驗(yàn)
采用單酶法和復(fù)合酶法提取多糖試驗(yàn)結(jié)果分別為237.537 mg·g-1和200.175 mg·g-1.酶法提取多糖的效率很高,比微波法和熱水浸提法都要高出不少,是提取茯苓多糖效率比較高的一種方法。綜合考慮酶量和節(jié)能,酶法進(jìn)行多糖提取的最佳工藝條件采用單酶法.
2.4 集成提取多糖試驗(yàn)
集成提取多糖試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5和表6.
表5 兩種方法集成提取茯苓多糖試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of two methods integrated extraction tests of polysaccharides ofPoria cocos
表6 三種方法集成提取茯苓多糖試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of three methods integrated extraction tests of polysaccharides ofPoria cocos
由表5可知,以酶法+微波法的多糖提取率最高,微波+酶法的多糖提取率稍低,酶法與微波法兩個(gè)組合的多糖提取率均高于單酶法.其他組合的多糖提取率均低于單酶法.本研究熱水浸提法與酶法的多糖提取率高于文獻(xiàn)[8]報(bào)道的結(jié)果.本研究酶法與微波法的多糖提取率也高于文獻(xiàn)[5]報(bào)道的結(jié)果.
由表6可知,以微波法+酶法+熱水浸提法的多糖提取率最高,酶法+微波法+熱水浸提法的多糖提取率與微波法+酶法+熱水浸提法的多糖提取率接近,這兩個(gè)組合的多糖提取率比酶法與微波法兩個(gè)組合的多糖提取率略高.
綜合考慮多糖提取效率、提取時(shí)間和提取成本等因素的影響,集成提取茯苓多糖的最佳工藝條件為酶法+微波法.該工藝提取條件溫和提取方式簡(jiǎn)單,提取時(shí)間較短,多糖提取效率較高.
在茯苓菌核多糖的分離工藝試驗(yàn)中,酶法與微波法集成的先后順序?qū)蜍叨嗵翘崛÷实挠绊懖皇翘?而酶法與微波法同熱水浸提法集成工藝的茯苓多糖提取率與酶法與微波法集成工藝的茯苓多糖提取率相比增加幅度不大,說(shuō)明酶法與微波法集成工藝可以有效提取茯苓菌核多糖.另外,本研究主要針對(duì)茯苓菌核多糖的集成工藝進(jìn)行了研究,而多糖分離方法對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性的影響需繼續(xù)深入探討.
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Study on isolation technology of polysaccharide of Poria cocossclerotium
ZHANG Kai1,LI Mao-f an1,HU Guo-yuan1,YAN Zhang-wei1,YANG Yang1, LI Wei-wei1,HU J ing,LI You-guo2
(1.Hubei Novel Reactor&Green Chemical Technology Key Laboratory, Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education, School of Chemical Engineering and Pharmacy,Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430074,China; 2.State Key Laboratory of Agricultural Microbiology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)
Isolation technology of polysaccharide ofPoria cocossclerotium were carried out with hot water extraction method,microwave method and enzyme method through single factor tests and orthogonal tests.The results showed that the optimal conditions of hot water extraction method were extraction at 70℃for 2 h with a ratio of material to water of 1:30(g/mL),extraction times 2.And the optimal conditions of microwave method were extraction at 296 W for 4 minutes with a ratio of material to water of 1:30(g/mL).And the optimal conditions of enzyme method were that papain, initial p H,time and temperature were 0.5%,6,2 h and 60 ℃,respectively.The extracting rate of pachyman of enzyme method was the highest.The extracting rates of pachyman of integrated extraction technology were dramatically raised. The extracting rate of pachyman of combined microwave extraction method with enzyme method was the highest.In view of effects of polysaccharide yield,time and costs et al.factors,the optimal integrated extraction technology to was combine enzyme method with microwave method.
Poria cocos;sclerotium polysaccharide;hot water extraction method;microwave method; enzyme method
TQ028
A
10.3969/j.issn.1674-2869.2011.01.007
1674-2869(2011)01-0025-03
2010-10-03
湖北省新型反應(yīng)器與綠色工藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(RGCT200901)
張凱(1985-),男,湖北武漢人,碩士研究生.研究方向:應(yīng)用化學(xué).
指導(dǎo)老師:胡國(guó)元,教授,博士.研究方向:食、藥用真菌代謝產(chǎn)物.*通信聯(lián)系人
本文編輯:張瑞
武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào)2011年1期