響應(yīng)面法優(yōu)化塊菌多糖提取工藝條件的研究

張世奇，闞建全，*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715; 2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點實驗室，重慶400715)

響應(yīng)面法優(yōu)化塊菌多糖提取工藝條件的研究

張世奇1，2，闞建全1，2，*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715; 2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點實驗室，重慶400715)

為確定塊菌多糖超聲中性水提取的最佳工藝條件，以塊菌多糖提取率為考察指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對主要提取工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并得到了回歸模型。研究結(jié)果表明:塊菌多糖超聲中性水提取的最優(yōu)工藝條件參數(shù)為超聲功率為105W，提取時間為40min，料液比為1∶25，提取溫度為75℃。在此條件下，塊菌多糖的提取率達(dá)到3.48%。實驗證明模型擬合程度良好，誤差較小，模型的選擇合適。

塊菌，多糖，響應(yīng)面法，超聲提取工藝條件

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

塊菌(Truffle) 產(chǎn)自四川省會東縣，真空包裝，凍藏備用;無水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、硫酸 成都市科龍化工廠，分析純。

FZ102型微型植物試樣粉碎機 北京市光明醫(yī)療儀器廠;KUBOTA3740型冷凍離心機 KUBOTA Corporation;RE52-98型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 亞榮生化儀器廠;超聲萃取裝置KQ3200DB 江蘇昆山市超聲儀器有限公司;UV-2000紫外分光光度計 上海尼柯儀器有限公司;HH-W420數(shù)顯三用恒溫水箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 塊菌多糖制備的基本工藝流程［5-6］塊菌原料→破碎(過100目)→70%(150W)超聲浸提→離心分離(4500r/min，15min)→減壓濃縮→乙醇沉淀→離心分離(4500r/min，15min)→溶劑干燥→粗多糖

1.2.2 單因素影響實驗［8］以中性水為提取劑，采用超聲處理，選用影響提取率的4個因素，即超聲時間、料液比、超聲功率(其工作頻率為40kHz，超聲電功率為150W)、提取溫度。按照1.2.1的制備方法提取塊菌多糖，并計算提取率。

1.2.3 響應(yīng)曲面法實驗設(shè)計 綜合單因素影響的實驗結(jié)果，采用Box-Behnken實驗設(shè)計方案選取超聲功率(W)、超聲時間(min)、料液比(mL/g)、提取溫度(℃)4個影響因素，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法，分別用X1、X2、X3、X4來表示，并以+1、0、-1分別代表變量的水平，按方程xi=(Xi-X0)/ΔX對自變量進(jìn)行編碼。其中xi為變量的編碼值。Xi為變量的真實值，ΔX為變量的變化步長，塊菌多糖的提取率Y為響應(yīng)值(表1)。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

1.2.4 塊菌多糖的提取率測定 粗多糖量的測定方法:苯酚-硫酸法［9］。以吸光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線(圖1)，并求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，表明在所實驗的0.1～1.0mg/100mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取多糖溶液1mL置于10mL的干燥比色管中，加入5%的苯酚1mL，混勻，再勻速滴加5mL濃硫酸，即刻搖勻。于沸水浴中加熱5min，冷卻至室溫后，在490nm處比色測吸光值。

粗多糖的提取率(%)=粗多糖的量/原料質(zhì)量×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對塊菌多糖提取率的影響

2.1.1 超聲功率對塊菌多糖提取率的影響 采用中性純水，料液比為1∶10，超聲時間為30min，提取溫度為60℃。考察超聲功率對多糖提取率的影響(圖2)。由圖2可知，塊菌多糖的提取率在超聲功率較低時隨著超聲功率的上升而增加，在超聲功率為105W時達(dá)到最大值，之后隨著超聲功率的增加，提取率下降，并在超聲功率為135W的時候，下降趨勢變緩。

圖2 超聲功率對塊菌多糖提取率的影響

2.1.2 超聲時間對塊菌多糖提取率的影響 采用中性純水，料液比為1∶10，超聲功率為105W，提取溫度為60℃。考察超聲時間對塊菌多糖提取率的影響(圖3)。

圖3 超聲時間對塊菌多糖提取率的影響

由圖3可知，塊菌多糖的提取率隨著超聲時間的增加而呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，這是由于隨著超聲時間的延長，細(xì)胞的破碎度越來越大，多糖就更加容易溶出。而當(dāng)超聲時間超過40min時，細(xì)胞內(nèi)的大量的不溶物質(zhì)和粘液質(zhì)等混入提取液中，使溶液中的雜質(zhì)增多，粘度變稠，從而影響了多糖的溶出。另外時間過長，會造成多糖的分解，也是后期多糖提取率下降的原因［10-11］。

2.1.3 料液比對塊菌多糖提取率的影響 采用中性純水，超聲時間為40min，超聲功率為105W，提取溫度為60℃?？疾炝弦罕葘K菌多糖提取率的影響(圖4)。

圖4 料液比對塊菌多糖提取率的影響

由圖4可知，隨著料液比的增大，塊菌多糖的溶出呈逐漸上升的趨勢，在1∶25時達(dá)到最大值，而后慢慢趨于穩(wěn)定。這是由于料液比較少時，不利于多糖的溶出。

2.1.4 提取溫度對提取率的影響 采用中性純水，超聲時間為40min，超聲功率為105W，料液比為1∶25。考察提取溫度對塊菌多糖提取率的影響(圖5)。

由圖5可知，隨著提取溫度的上升，塊菌多糖的提取率開始是緩慢上升，直至溫度達(dá)到65～75℃時，提取率迅速上升，而后又逐漸變緩甚至慢慢下降。這主要是由于溫度從室溫上升到65℃時，塊菌多糖在提取劑中的溶解度基本保持不變，所以在料液比一定的情況下，提取率沒有變化。但當(dāng)溫度達(dá)到80℃的時候，提取率有所下降，這可能是高溫下部分多糖被水解的結(jié)果。

表3 二次響應(yīng)模型方差分析

圖5 提取溫度對提取率的影響

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.2.1 實驗結(jié)果 實驗采用Box-Behnken設(shè)計［12-15］，用自變量X1、X2、X3、X4來表示超聲功率(W)、超聲時間(min)、料液比(g/mL)、提取溫度(℃)4個影響因素。以塊菌多糖的提取率為響應(yīng)值(Y)，其設(shè)計表與結(jié)果見表2。

利用Design Expert 7.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得出回歸模型參數(shù)方差分析見表3。

由方差分析可知，模型的P值顯著。失擬項P= 1.26(＞0.05)，差異不顯著，未知因素對實驗結(jié)果干擾小，說明殘差均由隨機誤差引起。R2=0.993，說明模型擬合程度良好，實驗誤差小，該模型能夠反映響應(yīng)值的變化。其二次方程為:

對表3的結(jié)果作響應(yīng)面分析，見圖6～圖11，其中各圖表示X1、X2、X3、X4中任意兩個變量取零水平時，其余兩個變量對多糖提取率的交互影響。

表2 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果

從圖8可以看出，在一定的范圍內(nèi)，塊菌多糖的提取率隨著超聲功率和提取溫度的增加而升高，兩者交互作用為極顯著。由圖10同樣可以看出，塊菌多糖的提取率也隨著超聲時間和提取溫度的增加而逐漸提高，兩者交互為極顯著。根據(jù)動力學(xué)原理，超聲溫度的升高，使得多糖分子的運動加劇，時間的延長有利于多糖的充分?jǐn)U散析出，隨著超聲功率的升高，使得多糖分子解附和擴(kuò)散的運動速率不斷加快，從而使提取率升高。由圖9看出，隨著超聲時間和料液比的不斷升高，多糖的提取率也隨之逐漸提高，兩者交互為顯著。從圖6、圖7、圖11可得其它幾種交互作用對多糖的提取率影響較小，兩者交互作用均為不顯著。

圖6 超聲功率與提取時間及其相互作用對塊菌多糖提取率影響的響應(yīng)面

圖7 超聲功率與料液比及其相互作用對塊菌多糖提取率影響的響應(yīng)面

圖8 超聲功率與溫度及其相互作用對塊菌多糖提取率影響的響應(yīng)面

圖9 超聲時間與料液比及其相互作用對塊菌多糖提取率影響的響應(yīng)面

圖10 超聲時間與溫度及其相互作用對塊菌多糖提取率影響的響應(yīng)面

圖11 溫度與料液比及其相互作用對塊菌多糖提取率影響的響應(yīng)面

2.2.2 驗證實驗 利用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合［16］，所得產(chǎn)品提取率最大值對應(yīng)的相關(guān)參數(shù)、預(yù)測值、驗證結(jié)果見表4。

表4 優(yōu)化工藝驗證結(jié)果

在優(yōu)化條件(超聲功率105W，超聲時間40min，料液比1∶25，提取溫度75℃)下對此優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗證，實際測定塊菌多糖提取率為3.48%，與預(yù)測值基本一致(相對誤差)，再次驗證了回歸方程的正確性。

3 結(jié)論

采用超聲中性水浸提法提取塊菌多糖，其優(yōu)化的工藝參數(shù)為:超聲功率104.7W，超聲時間40.4min，料液比1∶24.65，提取溫度75.05℃。依據(jù)現(xiàn)有實驗條件經(jīng)過微調(diào)，其最佳的工藝參數(shù)為:超聲功率105W，超聲時間40min，料液比1∶25，提取溫度75℃。通過3批次的驗證實驗，其多糖提取率平均3.48%，與預(yù)測值接近，證明了本實驗設(shè)計與分析方法較準(zhǔn)確可靠。

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Optimization of extraction technique of polysaccharides from truffles via response surface methodology(RSM)

ZHANG Shi-qi1，2，KAN Jian-quan1，2，*
(1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China; 2.Chongqing Key Laboratory of Produce Processing and Storage，Chongqing 400715，China)

Optimal processing parameters for ultrasonic-assisted extraction of truffle polysaccharide in neutral water medium were determined.On the basis of single factor experiments and according to Box-Behnken test design principles，the method of response surface method(RSM)for optimal parameters was adopted.Finally，the optimal extraction process was obtained as follows:ultrasonic power 105W，ultrasonic processing time 40min，ratio of liquid to sample 25∶1，extraction temperature 75℃.Under these conditions，the yield of polysaccharide truffles reached 3.48%.The model turned out to be with good fitting degree and minor error.

truffles;polysaccharide;response surface methodology;ultrasonic extraction conditions

TS201.2

B

1002-0306(2011)11-0345-05

塊菌(Perigord Truffle)又稱塊菇、松露、無娘藤、豬拱菌［1］等，屬于子囊菌亞門、塊菌目、塊菌科、塊菌屬［2-3］，是地下菌(Hypogeous fungi)中的一個比較重要的子囊菌類群。子實體在土壤中生長，除個別種類在成熟時半露出土表外，大部分種類自始至終埋生于地下，是與樹木共生的外生菌根型藥食兩用真菌。塊菌的主要活性成分有α-雄烷醇、神經(jīng)酰胺、塊菌多糖(polysaccharide of Tuber sinense，PST)等。研究表明，塊菌多糖作為一種新的真菌多糖，水溶性好、毒性低、抑制腫瘤作用明顯，可望開發(fā)成抗腫瘤免疫療法的藥物［4-5］。現(xiàn)有的提取多糖的方法主要為堿提取法、酸提取法和中性水提取法［6-7］，通過實驗驗證，酸法提取塊菌多糖效果不明顯且在酸性的條件下糖苷鍵容易被破壞，堿法提取后用90%的乙醇醇沉?xí)r多糖的凝沉效果不好且提取率相比熱水浸提沒有很明顯的提高。因此，考慮到后期實驗的純化工作，本實驗采用超聲中性水浸提法。

2010-11-12 *通訊聯(lián)系人

張世奇(1983-)，男，碩士研究生，研究方向:食品質(zhì)量與安全控制。