黑曲霉ATCC16404固體發(fā)酵豆皮產(chǎn)生木聚糖酶的研究

李愛軍，蔣文明，歐仕益，孫遠(yuǎn)明

(1.暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)系，廣東廣州510632;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642)

黑曲霉ATCC16404固體發(fā)酵豆皮產(chǎn)生木聚糖酶的研究

李愛軍1，2，蔣文明1，*，歐仕益1，孫遠(yuǎn)明2

(1.暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)系，廣東廣州510632;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642)

以豆皮為原料，用黑曲霉ATCC16404固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶，采用DNS測(cè)定酶活，研究了最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基配比，優(yōu)化產(chǎn)酶最佳條件。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)基配方為:以硫酸銨為氮源，礦質(zhì)元素添加硫酸鎂，添加量均為2%(w/w以豆皮干重計(jì))，豆皮顆粒大小為25～50目，不外加碳源，不加表面活性劑。選擇料液比、初始pH、培養(yǎng)時(shí)間、接重量?jī)?yōu)化產(chǎn)酶條件，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳產(chǎn)酶條件為:料液比1∶1.00(w/v)、初始pH5.5，培養(yǎng)時(shí)間3d，1.0×107/mL濃度孢子懸浮液接種0.3mL/10g，在此條件下酶活為366.29U/g。

黑曲霉，豆皮，木聚糖酶，固體發(fā)酵

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 青島高科園海博生物科技有限公司;黑曲霉(ATCC164O4) 美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心;豆皮 中糧新沙糧油工業(yè)(東莞)有限公司;玉米淀粉、小麥淀粉、酵母膏、蛋白胨、司盤、PEG(聚乙二醇)、PPG(聚丙二醇)、3、5－二硝基水楊酸

生化試劑;蔗糖、葡萄糖、甘油、CO(NH2)2、NH4Cl、NaNO3、(NH4)2PO4、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4· 7H2O、MgCl2、CaCl2均為分析純;木聚糖、木糖Sigma。

電子秤，分析天平，培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，顯微鏡，pH計(jì)，滅菌鍋，冰箱，移液器，恒溫水浴鍋，鼓風(fēng)干燥箱，分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以木糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(每重配一次DNS，重做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線)。

1.2.2 酶活測(cè)定

1.2.2.1 粗酶液制備 取1.50g發(fā)酵豆皮加入45mL檸檬酸－氫氧化鈉緩沖溶液，磁力攪拌器上攪拌30min，靜置過夜后紗布過濾除去豆皮，抽濾得到粗酶液。

1.2.2.2 木聚糖酶酶活測(cè)定 酶活定義:在50℃、pH4.8條件下，每分鐘分解底物釋放出1μmol還原糖(以木糖計(jì))所需要的木聚糖酶量為一個(gè)活力單位［15］。

樣品測(cè)定:取0.1mL適宜稀釋度的酶液加入0.1mL木聚糖底物，加緩沖溶液至1.5mL，50℃反應(yīng)30min，迅速冷卻后加入2mL DNS溶液［16］，沸水浴5min后用自來水冷卻，定容至10mL，在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

空白對(duì)照:取0.1mL木聚糖底物與1.3mL緩沖溶液，50℃反應(yīng)30min，冷水冷卻，加入2mL DNS溶液充分混合后加入0.1mL酶液，沸水浴5min后蒸餾水定容于10mL，在540nm處測(cè)定吸光度。

酶活計(jì)算公式［17］:

酶活力(U/g)=W×D×1000/150.2×30(min) ×0.1mL

式中:W為酶解反應(yīng)產(chǎn)生的木糖的質(zhì)量(mg);D為稀釋度(mL/g);1000為mmol轉(zhuǎn)化為μmol的系數(shù);150.2為木糖摩爾質(zhì)量(g/mol)。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

1.2.3.1 培養(yǎng)基組成的優(yōu)化 稱取10.00g豆皮加入10mL培養(yǎng)液，滅菌后接種黑曲霉ATCC16404，37℃培養(yǎng)3d。考察碳源、氮源、礦質(zhì)元素、豆皮顆粒大小、表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶酶活的影響。

1.2.3.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 在最優(yōu)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上考察時(shí)間、初始pH、接種量、料液比對(duì)產(chǎn)酶條件的影響，再在此基礎(chǔ)上選擇合適的培養(yǎng)條件做正交實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 碳源的選擇 考慮到黑曲霉在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較慢，培養(yǎng)基中加入2%碳源，使黑曲霉在培養(yǎng)初期快速生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)中加入蔗糖、葡萄糖、玉米淀粉、小麥淀粉與不外加碳源進(jìn)行比較，結(jié)果見圖1。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)2d和3d時(shí)豆皮培養(yǎng)基中黑曲霉的生長(zhǎng)情況無明顯區(qū)別，所以黑曲霉比較適合在豆皮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。由圖1得知，不外加碳源實(shí)驗(yàn)組與加玉米淀粉實(shí)驗(yàn)組得到的酶活差別比較小，可能是由于黑曲霉對(duì)玉米淀粉利用率低，而對(duì)葡萄糖的利用比較好，在加入葡萄糖后黑曲霉對(duì)半纖維素的利用率降低，所以在培養(yǎng)基中不加入其他碳源。2.1.2 氮源的選擇 豆皮中含有12%左右的粗蛋白［18－19］，考慮到黑曲霉對(duì)其的利用情況，在培養(yǎng)基中分別入2%的酵母膏、CO(NH2)2、蛋白胨、NH4Cl、NaNO3、(NH4)2SO4與不外加氮源進(jìn)行比較，選擇合適的氮源，結(jié)果見圖2。

圖1 不同碳源對(duì)酶活的影響

圖2 不同氮源對(duì)酶活的影響

由圖2得知，加入其它氮源后木聚糖酶酶活升高。相對(duì)于有機(jī)氮源，黑曲霉更適合于利用無機(jī)氮源，可能黑曲霉在利用大分子有機(jī)氮時(shí)要經(jīng)過分解，而無機(jī)小分子氮源可直接被吸收利用。NH4Cl與NaNO3對(duì)酶活的影響較小，可能是由于該菌種對(duì)其利用率較低。黑曲霉較適宜利用 CO(NH2)2和(NH4)2SO4，由圖2比較選擇(NH4)2SO4作為氮源。2.1.3 礦質(zhì)元素的選擇 在培養(yǎng)基中分別加入2%的KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MgCl2、CaCl2與不加礦質(zhì)元素進(jìn)行比較并比較不同礦質(zhì)元素對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同礦物元素對(duì)酶活的影響

由圖3比較得知，在礦質(zhì)元素添加量2%水平時(shí)，加入MgSO4·7H2O實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生酶的酶活最高，所以選擇在培養(yǎng)基中加入MgSO4·7H2O。KH2PO4與CaCl2添加組的酶活都比對(duì)照實(shí)驗(yàn)組低，可能是由于2%的添加量對(duì)于該菌種濃度過高從而抑制產(chǎn)酶。

2.1.4 豆皮顆粒大小的選擇 豆皮顆粒大小對(duì)黑曲霉發(fā)酵有重要影響，黑曲霉為需氧微生物，顆粒較小時(shí)，培養(yǎng)基透氣性降低，并且加入水后進(jìn)一步降低透氣性。顆粒過大使得黑曲霉與豆皮的接觸面積變小，增加了黑曲霉分解豆皮的難度。實(shí)驗(yàn)中選擇大于50目、25～50目、10～25目、小于10目、與未經(jīng)過篩選處理的豆皮5種不同顆粒大小的豆皮進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)比，結(jié)果見圖4。

圖4 豆皮顆粒大小對(duì)酶活的影響

由圖4可知，豆皮顆粒大小在25～50目之間所產(chǎn)生木聚糖酶酶活最高，選擇其作為培養(yǎng)基原料。

2.1.5 表面活性劑的選擇 添加表面活性劑，可以增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性和加強(qiáng)酶的運(yùn)輸，能不同程度地提高酶活［20］。實(shí)驗(yàn)中分別加入2%的聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、司盤60與不加表面活性劑實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較，結(jié)果見圖5。

圖5 不同表面活性劑對(duì)酶活的影響

圖5表明，添加PEG實(shí)驗(yàn)組酶活性比不加表面活性劑實(shí)驗(yàn)組酶活性略有增加，但并不顯著，所以在培養(yǎng)基中不加入表面活性劑。

2.2 培養(yǎng)條件的選擇

2.2.1 料液比對(duì)產(chǎn)酶酶活的影響 水分低不能滿足黑曲霉生長(zhǎng)與產(chǎn)酶的需要，水分含量太高則會(huì)使得培養(yǎng)基基質(zhì)粘連，透氣性降低，也不利于黑曲霉的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)以10g豆皮為原料，選擇1∶0.50、1∶0.75、1∶1.00、1∶1.25、1∶1.50料液比進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 料液比對(duì)酶活的影響

由圖6得知，在料液比為1∶1.00時(shí)酶活性最高，水分過高或太低都會(huì)影響酶活性，經(jīng)比較選擇料液比1∶0.75、1∶1.00、1∶1.25三個(gè)水平做正交實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶酶活性的影響 實(shí)驗(yàn)選擇2、3、4、5、6d培養(yǎng)時(shí)間，測(cè)定木聚糖酶酶活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響

黑曲霉在培養(yǎng)2d時(shí)已經(jīng)長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，但酶活性相對(duì)較低。由圖7分析得木聚糖酶酶活在培養(yǎng)5d時(shí)達(dá)到最大值，3d后酶活性增高并不顯著，可能由于代謝產(chǎn)物增加到一定量抑制了黑曲霉產(chǎn)生木聚糖酶。

2.2.3 初始pH對(duì)產(chǎn)酶酶活性的影響 pH對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖影響很大，主要是影響細(xì)胞膜的電荷從而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，另一方面是影響代謝過程中酶的活性從而影響微生物的生命活動(dòng)［21］。實(shí)驗(yàn)選擇初始pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)黑曲霉產(chǎn)酶酶活，結(jié)果見圖8。

圖8 初始pH對(duì)酶活的影響

由圖8得知，pH過高或過低對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶酶活性影響比較大。在pH5.5時(shí)產(chǎn)生的木聚糖酶活性最高，選擇其作為培養(yǎng)基的pH。

2.2.4 接種量對(duì)產(chǎn)酶酶活性的影響 接種量會(huì)影響酶活性，接種量少時(shí)，生長(zhǎng)較慢，酶活也較低;接種量多時(shí)，酶活也不高，菌體生長(zhǎng)過快，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)主要被菌體用于自身的生長(zhǎng)［8，22］，并且曲溫升高，不利于產(chǎn)酶［8］。實(shí)驗(yàn)中配制1.0×107/mL的孢子懸浮液，10g豆皮中接種量分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，結(jié)果見圖9。

由圖9得知，孢子接種量為0.3mL時(shí)酶活達(dá)到最高。接種量在0.1、0.5mL時(shí)酶活比較低，在接種量為0.1mL時(shí)，可能由于菌種接種量過少，在發(fā)酵時(shí)間為3d時(shí)培養(yǎng)基中葡萄糖被利用盡。在接種量為0.5mL時(shí)，由于發(fā)酵初期菌種生長(zhǎng)過快，可能導(dǎo)致發(fā)酵期間產(chǎn)熱過多而影響了產(chǎn)酶活動(dòng)。因此選擇0.2、0.3、0.4mL作為正交實(shí)驗(yàn)的因素水平。

圖9 接種量對(duì)酶活的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

由培養(yǎng)條件單因素實(shí)驗(yàn)選擇合適的單因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(見表1)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由于正交實(shí)驗(yàn)與單因素實(shí)驗(yàn)使用了同一菌種的不同培養(yǎng)批次，使得正交實(shí)驗(yàn)中所測(cè)定的酶活整體偏低一些。由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知各個(gè)實(shí)驗(yàn)因素中木聚糖酶酶活的變化趨勢(shì)與單因素中基本一致。由極差分析得料液比對(duì)產(chǎn)酶影響比較大，其次為培養(yǎng)時(shí)間與初始pH，接種量的影響相對(duì)較小。在正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，表觀分析可知，最佳產(chǎn)酶條件為料液比1∶1.00、初始pH為5.5、培養(yǎng)時(shí)間為4d、濃度為1.0×107/mL孢子懸浮液接種量為0.2mL/10g。

表1 正交設(shè)計(jì)因素與水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果表明A2B2C3D2為最優(yōu)工藝組合，而正交結(jié)果顯示，C因素中4d相比較3d酶活變化很小，并且考慮到培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)增加工藝生產(chǎn)成本和產(chǎn)品中的孢子量，所以取C2水平時(shí)的A2B2C2D2組合，與表觀最佳工藝組合(正交實(shí)驗(yàn)中的5號(hào))相比較。結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) A2B2C2D2組合時(shí)測(cè)得酶活為366.29U/g。與表觀最佳工藝組合相比較略低，可能是由于某些單因素之間存在一定的相互作用，使得最佳工藝組合的酶活不是很高。接種量在0.2mL/10g時(shí)，通過延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間同樣可以提高酶活。由于兩個(gè)組合的酶活相差很小，并且考慮到發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)增加生產(chǎn)成本，所以選擇A2B2C2D2組合為最佳工藝條件。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化培養(yǎng)基，選擇(NH4)2SO4作為氮源，MgSO4·7H2O作為礦質(zhì)元素添加，選擇25～50目顆粒大小的豆皮作為發(fā)酵原料，不外加碳源，不加表面活性劑。相對(duì)于大分子碳源和氮源，黑曲霉(ATCC164O4)更容易利用小分子碳源和氮源，添加葡萄糖可以加快黑曲霉生長(zhǎng)，但延緩黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶生長(zhǎng)。豆皮顆粒大小與料液比對(duì)黑曲霉產(chǎn)酶影響比較大，黑曲霉(ATCC164O4)適于在酸性pH條件下生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)選擇料液比、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH、接種量對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在產(chǎn)木聚糖酶影響上各因素之間存在相互作用，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證表明，最佳產(chǎn)酶條件為料液比1∶1.00、初始pH5.5，培養(yǎng)時(shí)間3d，1.0×107/mL孢子濃度的菌液接種0.3mL/10g，在此條件下酶活為366.29U/g。

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Xylanase production by Aspergillus niger ATCC16404 in solid－state fermentation of soybean hull

LI Ai－jun1，2，JIANG Wen－ming1，*，OU Shi－yi1，SUN Yuan－ming2
(1.Food Science Department，College of Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China; 2.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

Components of incubation media and followed by the best conditions for enzyme production were optimized in solid－state fermentation of soybean hull by Aspergillus niger ATCC16404 to produce xylanase，whose activity was determined by DNS.Results of single factor experiments showed that the optimum components of incubation media contain ammonium sulfate and magnesium sulfate used as nitrogen source and mineral element，with 2%addition based on the weight of 25～50 mesh dry soybean hull，and without additional carbon source and surfactant.Solid－to－liquid ratios，initial pH，incubation time，inoculum size were selected to optimize the condition of enzyme production.Orthogonal experiment showed the highest xylanase activity was 366.29U/g at the optimum fermentation conditions of solid－to－liquid ratio 1∶1.00，initial pH 5.5，3d incubation，0.3mL/10 g spore suspension of 1.0×107/mL concentration.

Aspergillus niger;soybean hull;xylanase;solid－state fermentation

TS201.3

A

1002－0306(2011)12－0261－05

豆皮為大豆加工副產(chǎn)物，大豆皮約占整粒大豆總重的8%，2009年我國(guó)大豆進(jìn)口量為4255萬t，國(guó)內(nèi)產(chǎn)量1450萬t，所以每年都有很多豆皮產(chǎn)生。豆皮在很多方面都有應(yīng)用:從豆皮中提取納米纖維素可作為強(qiáng)化纖維用于生物復(fù)合材料中［1］;豆皮中提取的果膠［2－3］，半乳糖醛酸含量最高達(dá)88.3%，而且不同干燥方式(冷凍干燥、冷凍干燥、真空干燥)對(duì)豆皮果膠溶解性和流動(dòng)性沒有顯著破壞作用［4］;高里假絲酵母發(fā)酵豆皮水解物產(chǎn)乙醇效果較好［5］;豆皮可以不經(jīng)前處理，由啤酒酵母直接發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，還能夠保留原有蛋白質(zhì)價(jià)值［6］;Khushal Brijwani等［7］利用里氏木霉和米曲霉混合菌固體發(fā)酵攙雜麥麩的豆皮生產(chǎn)纖維素酶系;實(shí)驗(yàn)表明，相對(duì)酸前處理，該酶系對(duì)堿前處理原料的糖化效果較好。目前國(guó)內(nèi)主要利用玉米芯、麩皮等作為產(chǎn)生木聚糖酶的原料［8－10］。木聚糖酶廣泛用于面包、飲料、紡織、造紙、廢水處理［11－12］等方面，以及作為動(dòng)物飼料添加劑［13－14］。本研究利用黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生木聚糖酶，旨在為木聚糖酶制劑的研制與豆皮深加工利用提供參考。

2010－10－25 *通訊聯(lián)系人

李愛軍(1966－)，男，博士，副教授，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品深加工與利用。

廣東高?？萍汲晒a(chǎn)業(yè)化重大項(xiàng)目(cgzhzd0709)。