HPLC內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定十三香中胡椒堿和6-姜酚的含量

林先哲，郭墨婷，吳珍菊，呂夢(mèng)莎，黃雪松

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632)

HPLC內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定十三香中胡椒堿和6-姜酚的含量

林先哲，郭墨婷，吳珍菊，呂夢(mèng)莎，黃雪松*

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632)

目的:建立快速、準(zhǔn)確并同時(shí)測(cè)定十三香中姜酚和胡椒堿含量的方法。方法:采用 HPLC法，色譜柱為Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-水梯度洗脫，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。結(jié)果:內(nèi)標(biāo)法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的測(cè)定結(jié)果一致;胡椒堿在5～160μg/mL、姜酚和姜酚肟在20～640μg/mL時(shí)，峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系;相關(guān)系數(shù)分別為0.9995、0.9997、0.9995。十三香中胡椒堿和姜酚的含量分別為:20.23、4.33mg/g。結(jié)論:用姜酚肟做內(nèi)標(biāo)測(cè)定產(chǎn)品中姜酚和胡椒堿的方法既不用重復(fù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，又可同時(shí)測(cè)定兩種成分的含量。

胡椒堿，姜酚肟，姜酚

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無(wú)水甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純) 購(gòu)自迪瑪科技;水 經(jīng)過(guò)濾后的純凈水;胡椒堿 購(gòu)自西安華萃生物技術(shù)有限公司，純度為98%;6-姜酚標(biāo)樣 購(gòu)自日本W(wǎng)AKO公司，純度大于98%;6-姜酚肟標(biāo)樣實(shí)驗(yàn)室自制［16-17］，經(jīng)歸一化法測(cè)定其純度＞95%;樣品 某市售十三香粉。

LC-20AT高效液相色譜儀(配備SPD-M20A光電二極管陣列檢測(cè)器、Class-vp色譜工作站) 日本島津公司;超聲波振蕩器 江蘇宏華儀器廠; SK3310LHC水浴恒溫振蕩器 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精確稱(chēng)取胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品0.016g，置于100mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，配成160μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精確量取該儲(chǔ)備液，倍比稀釋成160、80、40、20、10、5μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精確稱(chēng)取6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品0.064g，置于100mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，配成640μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精確量取該儲(chǔ)備液，倍比稀釋成640、320、160、80、40、20μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 6-姜酚肟標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精確稱(chēng)取6-姜酚肟標(biāo)準(zhǔn)品0.064g，置于100mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，配成640μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精確量取該儲(chǔ)備液，倍比稀釋成640、320、160、80、40、20μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.4 供試品溶液的配制 取某市售2.00g十三香粉，置于50mL容量瓶中，加入乙醇50mL并放入30℃恒溫?fù)u床2h，放冷后再定容，過(guò)濾待測(cè)。

1.3 HPLC測(cè)定條件

色譜柱：Diamonsil(TM)C18柱，250mm×4.6mm，5μm;流動(dòng)相：A，水;B，乙睛;流速1mL/min;柱溫：室溫;檢測(cè)波長(zhǎng)280nm;進(jìn)樣體積20μL。

表1 HPLC梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系的考察

取1.2.1，1.2.2，1.2.3所配系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC測(cè)定，進(jìn)樣量均為20μL。每個(gè)濃度測(cè)定3次，峰面積取平均值。以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。胡椒堿的線性回歸方程Y=4.143X×104-5913，(R2= 0.999，n=6);姜酚的線性回歸方程Y=7.51X ×103+26016，(R2=0.999，n=6);姜酚肟的線性回歸方程Y=9.68X×103+24592，(R2=0.999，n=6)。結(jié)果表明其相關(guān)程度高，能夠反映胡椒堿、姜酚、姜酚肟濃度與各自峰面積的關(guān)系。胡椒堿在質(zhì)量濃度5～160μg/mL，姜酚在質(zhì)量濃度20～640μg/mL，姜酚肟在質(zhì)量濃度20～640μg/mL時(shí)峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。按一定比例混合三種標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照?qǐng)D，見(jiàn)圖1。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取胡椒堿、6-姜酚、6-姜酚肟標(biāo)準(zhǔn)溶液各一份，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.9%、0.6%和0.8%，該誤差在儀器分析誤差范圍之內(nèi)。

2.3 姜酚肟回收率的測(cè)定

圖1 三種標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照?qǐng)D

在供試品中加入已知量的6-姜酚肟，進(jìn)行回收率測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表2。結(jié)果表明：用6-姜酚肟做內(nèi)標(biāo)測(cè)定樣品中6-姜酚及胡椒堿含量時(shí)，6-姜酚肟穩(wěn)定，不與其他物質(zhì)反應(yīng)，符合內(nèi)標(biāo)的要求。

2.4 相對(duì)校正因子的測(cè)定

精確量取6-姜酚肟標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別與胡椒堿、6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)溶液混合;再按照倍比稀釋逐級(jí)稀釋5次，進(jìn)樣量20μL，重復(fù)以上步驟6次，峰面積取平均值，得到胡椒堿對(duì)6-姜酚肟的相對(duì)校正因子(fi/fs)及6-姜酚對(duì)6-姜酚肟的相對(duì)校正因子(fj/fs)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

該表數(shù)據(jù)顯示，相對(duì)校正因子(fj/fs)與前人所得的6-姜酚對(duì)6-姜酚肟的相對(duì)校正因子相同;但因色譜柱，檢測(cè)條件等不同，從而導(dǎo)致回歸方程有所差異［18］。

2.5 樣品測(cè)定

取1.2.4所配溶液8mL，加入2mL內(nèi)標(biāo)物6-姜酚肟(640μg/mL)，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。其HPLC圖見(jiàn)圖2。重復(fù)三次，并分別進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法計(jì)算胡椒堿和6-姜酚的含量，其結(jié)果見(jiàn)表4。

圖2 樣品HPLC圖

表4 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法比較(mg·g-1)

表4結(jié)果經(jīng)過(guò)F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)(置信度95%)，兩種方法沒(méi)有顯著差異，不存在系統(tǒng)誤差。

3 結(jié)論

通過(guò)回收率、精密度等指標(biāo)檢查以及與6-姜酚、胡椒堿外標(biāo)法的比較，證實(shí)以6-姜酚肟為內(nèi)標(biāo)同時(shí)測(cè)定樣品中的6-姜酚及胡椒堿是可行的。采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定這兩種物質(zhì)的含量，既不用重復(fù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，又可以避免由于胡椒堿和姜酚標(biāo)樣不穩(wěn)定導(dǎo)致的誤差，而且本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)條件能同時(shí)測(cè)定產(chǎn)品中兩種物質(zhì)的含量;從而達(dá)到節(jié)省時(shí)間和試劑、降低檢測(cè)成本和誤差的目的。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 相對(duì)校正因子

［1］湯蕾.植物性香辛料及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.中國(guó)調(diào)味品，2008，11(6):134-139.

［2］Aeschbach R，Loliger J，Scott B C，et al.Antioxidant actions of thymol，carvacrol，6-gingerol，zingerone and hydroxytyrosol［J］. Food and Chemical Toxicology，1994(32):31-36.

［3］黃雪松，宴日安，吳建中.姜酚的生物活性述評(píng)［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版，2005，26(3):434-439.

［4］劉紅，趙建平，譚樂(lè)和.胡椒堿的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)調(diào)味品，2008，10(2):33-36.

［5］Bae，G S，et al.Inhibition of lipopolysaccharide-induced inflammatory responses by piperine［J］.European Journal of Pharmacology，2010，642:154-162.

［6］Parmar，V S，et al.Polyphenols and alkaloids from Piper species［J］.Phytochemistry，1998，49:1069-1078.

［7］Verzele M，Qureshi S.HPLC Determination of Piperine in Pepper and in Pepper Extracts［J］.Short Communications，1980，13:241-243.

［8］Scott I M，Puniani E，Jensen H，et al.Analysis of Piperaceae germplasm by HPLC and LCMS:A method for isolating and identifying unsaturated amides from Piper spp extracts［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53:1907-1913.

［9］Kozukue N，Park M S，Choi S H，et al.Kinetics of lightinduced cis-trans isomerization of four piperines and their levels in ground black peppers as determined by HPLC and LC/MS［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55:7131 -7139.

［10］Rai P D，Pathak A，Rajput S J.RP-LC Simultaneous Determination of Aconitine，Solanine and Piperine in an Ayurvedic Medicine［J］.Chromatographia，2009，69:1275-1282.

［11］VermaJK，JoshiA V.RapidHPTLCmethodfor identification and quantification of curcumin，piperine and thymol in an ayurvedic formulation［J］.Journal of Planar Chromatography -Modern TLC，2006(19):398-400.

［12］朱國(guó)元，彭國(guó)平，等.HPLC內(nèi)標(biāo)法測(cè)定干姜和飽姜中6-姜酚的含量［J］.中藥材，2001，24(9):652-653.

［13］姜芳，王佳堃，劉建新.內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸和乳酸的方法探究［J］.中國(guó)畜牧雜志，2009，45(21):73-76.

［14］林先哲，黃雪松.HPLC法測(cè)定胡椒花、幼果和成熟果中胡椒堿的含量［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36(3):141-143.

［15］黃雪松.姜酚測(cè)定方法研究［J］.中國(guó)調(diào)味品，2004(2): 31-35.

［16］黃雪松，晏日安，李?lèi)?ài)軍.6-脫氫姜酚的制取與鑒定［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006(10):37-42.

［17］黃雪松，張寧.結(jié)晶姜酚的制取與鑒定［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005(5):15-19.

［18］曲翔，盧曉旭，黃雪松.以6-姜酚肟為內(nèi)標(biāo)測(cè)定生姜及其制品中 6-姜酚的含量［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007(6): 123-125.

Simultaneous determination of piperine and 6-gingerol in condiment by HPLC internal standard method

LIN Xian-zhe，GUO Mo-ting，WU Zhen-ju，LV Meng-sha，HUANG Xue-song*
(Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

The content of piperine and 6-gingerol in condiment were investigated by RP-HPLC with Diamonsil column(C18，5μm，250mm×4.6mm)at room temperature and 280nm.The mobile phase was water-methanol (gradient elution)with flow rate of 1mL/min.The 6-gingerol oxime was used as the internal standard.There was no distinct difference between the external standard method and internal standard method.The result showed that the linear range of piperine was 5～160μg/mL，while 6-gingerol and 6-gingerol oxime were 20～640μg/mL.The correlation coefficient were 0.9995，0.9997 and 0.9995，respectively.This condiment contained 20.23mg/g piperine and 4.33mg/g 6-gingerol.These results concluded that the method had no need to make standard curve duplicatly and can detect piperine and 6-gingerol simultaneously.

pipperjine;6-gingerol;6-gingerol oxime

TS207.3

A

1002-0306(2011)12-0452-03

十三香粉由胡椒、干姜、肉桂等十三種香料組成，治療脾胃受寒、中陽(yáng)不振、脘腹冷痛、寒瀉冷痢、產(chǎn)后氣血阻滯、少陰沉寒、浮熱牙疼等癥［1］。其中姜酚類(lèi)物質(zhì)(如6-姜酚)為干姜的主要有效成分，有抑制前列腺素合成、防腐殺菌、驅(qū)蟲(chóng)、護(hù)膚美容等多種功能［2-3］。胡椒堿為胡椒的主要辣味物質(zhì)，有抗炎、治療胃潰瘍、降血脂、抗癌、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、殺蟲(chóng)等活性［4-5］。由于胡椒堿和姜酚都容易受酸、堿、熱等因素影響而被破壞［6］;要同時(shí)測(cè)定十三香等混合香料中這兩種物質(zhì)的含量時(shí)，按照前人所用檢測(cè)條件［7-9］，不足以使胡椒堿和6-姜酚出峰效果清晰。而Rai P D同步測(cè)定烏頭堿、龍葵堿、胡椒堿［10］及Verma同步檢測(cè)姜黃素、胡椒堿和麝香草酚［11］時(shí)，均使用在不同時(shí)間段變波長(zhǎng)的方法達(dá)到檢測(cè)目的。然而該方法波峰雖然明顯，但波峰之前分離不開(kāi)，會(huì)相互影響。本實(shí)驗(yàn)研究利用姜酚肟做內(nèi)標(biāo)［12-13］，根據(jù)有關(guān)研究［14-15］的檢測(cè)條件加以改良，以便同時(shí)測(cè)定十三香中胡椒堿和姜酚含量。

2010-12-13 *通訊聯(lián)系人

林先哲(1985-)，男，碩士研究生，研究方向:功能食品。

廣東省高校科技成果產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(cgzhzd0806);農(nóng)業(yè)部公益項(xiàng)目(200903018)。