異硫氰酸酯分析方法研究進(jìn)展

胡國偉，楊瑛潔，李淑燕，胡小松，廖小軍，張 燕

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，教育部果蔬加工工程研究中心，北京100083)

異硫氰酸酯分析方法研究進(jìn)展

胡國偉，楊瑛潔，李淑燕，胡小松，廖小軍，張 燕*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，教育部果蔬加工工程研究中心，北京100083)

異硫氰酸酯(ITCs)是一類通式為R－N=C=S的有機(jī)化合物。它們是十字花科某些蔬菜的獨(dú)特風(fēng)味成分，具有多種生理活性。重點(diǎn)對ITCs定性、定量分析方法的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和介紹。

異硫氰酸酯(ITCs)，定性，定量

在花椰菜、甘藍(lán)、芥菜、蘿卜等十字花科植物的根、莖、葉和種子細(xì)胞中存在大量硫代葡萄糖苷(Glucosinolates，縮稱 GS，簡稱硫苷，又稱黑芥子苷)［1］。硫苷與硫代葡萄糖苷酶反應(yīng)會生成一類通式為R－N=C=S的有機(jī)化合物，稱為異硫氰酸酯(ITCs)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的大概有100種 ITCs，常見的ITCs主要包括:萊菔硫烷(SFN)、烯丙基異硫氰酸酯(AITC)、苯基異硫氰酸酯(BITC)、苯甲基異硫氰酸酯(PITC)和苯乙基異硫氰酸酯(PEITC)五種，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。由于ITCs分子中的－N=C=S結(jié)構(gòu)有兩個π鍵，存在于負(fù)電性不同的氮、硫原子之間，易發(fā)生極化，使ITCs的化學(xué)性質(zhì)較活潑。同時，ITCs具有諸多的特殊生理活性，如能夠抑制癌癥細(xì)胞和腫瘤生長、具有殺菌和抗血小板凝集作用，能夠顯著降低患腎、前列腺、膀胱、結(jié)腸、直腸和肺癌等的危險。另外，ITCs具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，賦予了十字花科植物辛辣刺激的口感和特殊的風(fēng)味。ITCs具有活潑的化學(xué)性質(zhì)和較強(qiáng)的揮發(fā)性，使ITCs的準(zhǔn)確定性定量分析有一定困難，因而在研究過程中，研究者開發(fā)了大量的定性、定量方法，以適應(yīng)不同檢測、分析的要求。鑒于此，本文對ITCs的定性、定量分析方法進(jìn)行了系統(tǒng)的分析、比較，為ITCs分析方法的深入研究與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

圖1 五種ITCs的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 定性分析

隨著儀器分析科學(xué)的迅猛發(fā)展，很多先進(jìn)的分析儀器及技術(shù)被用于ITCs的定性分析。目前用于ITCs的定性分析方法主要包括氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography－mass spectrometry，GC－MS)、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用 (liquidchromatography－mass spectrometry，LC－MS)、紅外吸收光譜(infrared absorption spectroscopy，IR)和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)等。

1.1 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC－MS)

大多數(shù)ITCs化合物具有一定揮發(fā)性，用GC分離，結(jié)合MS的高靈敏度，能對多組分的ITCs進(jìn)行分離和鑒定。很多研究者采用這種方法分析了植物的根、葉、種子各部分以及風(fēng)味成分中的ITCs。

采用GC－MS分析時，樣品的前處理是至關(guān)重要的一個步驟，目前采用較多的是有機(jī)溶劑提取和固相微萃取(solid－phase microextraction，SPME)。由于ITCs的非極性較強(qiáng)，易溶于有機(jī)溶劑，因此在提取ITCs時常用二氯甲烷、戊烷等溶劑。吳元鋒等［2］用GC－MS分析了花椰菜、白菜、甘藍(lán)、芥藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、大頭菜、西蘭花7種蕓苔屬植物和蘿卜種子水解液中的ITCs，共鑒定出12種ITCs化合物，主要有異硫氰酸烯丙酯、異硫氰酸－3－丁烯酯、異硫氰酸苯乙酯、蘿卜硫素、告伊春等。進(jìn)行樣品前處理時，將種子粉碎得到粉末進(jìn)行索氏萃取脫脂，然后加入二氯甲烷和磷酸緩沖液25℃水解提取8h，最后經(jīng)過干燥、過濾、真空濃縮、定容得到所需分析樣品。楊艷婧等［3］利用相同的樣品前處理方法，通過GC－MS從西蘭苔籽提取物中成功鑒定出苯甲基異硫氰酸酯、萊菔硫烷等5種ITCs。

Troncoso等［4］在從卷心菜葉子中提取的硫代葡萄糖苷的凍干粉末中加入硫代葡萄糖苷酶，37℃反應(yīng)3h，得到硫代葡萄糖苷酶解產(chǎn)生的ITCs，然后用SPME進(jìn)行收集，用GC－MS進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，其中主要含有烯丙基異硫氰酸酯、苯甲基異硫氰酸酯、2－苯乙基異硫氰酸酯和苯基異硫氰酸酯。Romeo等［5］利用SPME和GC－MS分析了酸豆的145種風(fēng)味成分，其中在含硫成分中，甲基異硫氰酸酯所占比例最大，其次是苯甲基異硫氰酸酯。Taveira等［6］則應(yīng)用SPME和GC－MS定性分析了白菜在成熟過程中的風(fēng)味成分，結(jié)果表明異硫氰酸酯類是最主要的風(fēng)味成分，而3－丁烯基異硫氰酸酯所占的比例最大。

1.2 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC－MS)

LC－MS技術(shù)是另一種常用的ITCs定性分析方法。該法具有分析范圍廣、分離能力強(qiáng)、檢測限低、分析時間短、定性分析結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。在應(yīng)用LC－MS定性分析ITCs時，大多數(shù)樣品需要先通過胺類衍生劑衍生為硫脲，以便提高色譜分離效果和質(zhì)譜的檢測效果。與GC－MS技術(shù)相比，LC－MS在樣品的前處理上相對復(fù)雜、耗時。Song等［7］用LC－MS方法分析了蕓苔屬蔬菜種子提取物中的ITCs。ITCs先用氨水衍生為硫脲，然后應(yīng)用LC－MS進(jìn)行定性分析，檢出限為0.5～2pmol，回收率為50%～85%。Rose等［8］運(yùn)用LC－MS分析人體食用西洋菜后的尿液，測定出了N－乙酰半胱氨酸偶聯(lián)苯乙基異硫氰酸酯(PEITC)等三種ITCs，他們認(rèn)為LC－MS能廣泛應(yīng)用于植物提取物和人體尿液中復(fù)雜的硫代葡萄糖苷代謝的測定。

1.3 紅外吸收光譜(IR)

紅外吸收光譜法具有特征性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣、用樣量少、分析速度快等特點(diǎn)。Lieber等［9］研究了幾種硫氰酸酯和異硫氰酸酯的紅外光譜，結(jié)果表明硫氰酸酯和異硫氰酸酯分別在 2140cm－1和 2060～2105cm－1處有特征吸收，并以此作為定性分析兩者的依據(jù)。Ham等［10］研究了芥子油中一系列脂肪族和芳香族ITCs的紅外光譜，ITCs在2100 cm－1處有顯著的特征吸收，且脂肪族和芳香族ITCs有不同的光譜輪廓，通過分析比較這些光譜可以有效區(qū)分具有特異性成分的ITCs。

1.4 核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)

在新的ITCs化合物定性分析中，通常采用多種檢測分析手段進(jìn)行驗(yàn)證，NMR就是其中重要的一種。特別在確定未知官能團(tuán)的化合物時，NMR具有明顯的優(yōu)勢。Makoto等［11］用GC和HPLC分離了日本山葵乙醇提取液中的生物活性成分，并參照其1H和13C譜分析出其化學(xué)結(jié)構(gòu)為 6－methylsulfinylhexyl isothiocyanate。Leoni等［12］用GC－MS技術(shù)分析鑒定了黑芥子酶酶解硫代葡萄糖苷生成的異硫氰酸酯的結(jié)構(gòu)，然后用1H NMR驗(yàn)證了得到的結(jié)構(gòu)。

2 定量分析

ITCs的定量分析方法經(jīng)過近一個世紀(jì)的發(fā)展，種類較多，主要包括銀量法、滴定法、重量法、電位分析法、比色法、硫脲紫外法、紅外分光光度法、紫外分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法。下面僅就目前最為常用和最新的定量分析方法進(jìn)行介紹和比較。

2.1 滴定法

滴定法(包括六氫吡啶直接滴定法［13］、哌嗪非水滴定法［14］、嗎啉滴定法［15］、氯胺－T間接氧化法［16］、二乙胺滴定法［17］、二硫代碳氨酸形成法［18］等)，其具有設(shè)備簡單、操作方便等特點(diǎn)，但靈敏度較低。主要用于芥末油、辣根粉中的異硫氰酸酯的快速檢測。就這幾種滴定方法相比而言，二硫代碳氨酸形成法操作簡便快捷、成本低廉、尤其反應(yīng)所需時間短，僅需30min。另外通過對照實(shí)驗(yàn)和添加回收實(shí)驗(yàn)，該法的準(zhǔn)確度達(dá)到 95.8%～102.7%，回收率達(dá) 95.0%～103.5%，表明該法準(zhǔn)確可靠，應(yīng)用于芥末油、辣根粉樣品中ITCs的測定，結(jié)果令人滿意。

2.2 銀量法

銀量法是最古老的一種異硫氰酸酯定量分析方法，是Gadamer［19］于1899年提出的。原理為ITCs蒸餾通入氨水中，生成相應(yīng)的硫脲類化合物，在后者中加入過量的硝酸銀，生成不溶解的硫化銀和碳化二亞胺［C(NH2)2］，剩余的硝酸銀用經(jīng)典的伏爾哈德容量法測定。該方法已被我國作為國標(biāo)用于菜籽餅粕中ITCs的測定，該方法的缺點(diǎn)是反應(yīng)時間長，測定工序較復(fù)雜。

2.3 硫脲紫外法

硫脲紫外法最早是由加拿大學(xué)者 Wetter和Youngs在1976年建立的。該法是測定硫甙的加拿大國標(biāo)，它測定的是異硫氰酸酯(ITC)與惡唑烷硫酮(OZT)混合體，以ITC+OZT表示硫甙含量，并可同時測定OZT含量，但無法用于測定ITC的含量。

潘雷等［20］在前人研究硫脲紫外法的基礎(chǔ)上，利用硫脲紫外法對菜籽餅粕中硫甙、OZT含量進(jìn)行了測定，根據(jù)硫甙降解原理，推導(dǎo)出ITC的計算公式，并通過與銀量法進(jìn)行比較，得出該法操作簡便快捷，最小檢測限達(dá)到300～500mg/kg。目前硫脲紫外法主要應(yīng)用于低硫代葡萄糖苷油菜種子選育和飼料分析中ITCs含量的檢測。

2.4 紫外分光光度法

Zhang等［21］報道了一種用紫外分光光度法測定ITCs含量的方法，主要利用－N=C=S基團(tuán)中具有高度親電性的中心C原子與衍生劑中鄰近C上的巰基發(fā)生定量環(huán)縮合反應(yīng)，產(chǎn)物具有較好的紫外光譜吸收，可以用來定量。通常情況下是ITCs與1，2－苯二硫酚(1，2－BDT)環(huán)縮化反應(yīng)生成1，3－苯二硫雜環(huán)五烯－2－硫酮(1，3－BDTT)，然后測定1，3－BDTT在365nm處最大紫外吸收定量。

張清峰等［22］報道了應(yīng)用紫外分光光度法測定辣根及芥末制品中ITCs含量，該方法直接測定了ITCs的正己烷提取液在249nm處的吸光值，測定一個樣品僅需20 min。與滴定法相比，操作時間短、靈敏度高，更加簡便易行。

肖華志［23］用紫外分光光度法分別對芥末油、芥末醬和沖菜三種不同形式樣品中烯丙基異硫氰酸酯含量進(jìn)行定量分析。紫外分光光度法回收率范圍為98.46%～99.18%，變異系數(shù)均小于3%，因此該方法是可靠的。

2.5 色譜法

隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，以及其擁有靈敏度高、操作簡單、適于微量測定等優(yōu)點(diǎn)，色譜法在ITCs的定量分析中應(yīng)用越來越廣泛，成為目前最新的ITCs定量分析方法。與紫外分光光度法相比，色譜法所需設(shè)備昂貴，對樣品的前處理要求較高，但分辨率和靈敏度高。

2.5.1 氣相色譜法(gas chromatography，GC)GC定量分析ITCs時，可以用火焰光度(flame photometric detector，F(xiàn)PD)［24］、火焰離子化 (flameionization detector，F(xiàn)ID)［25－27］、質(zhì)譜(MS)［28］等檢測器，可用色譜柱有填充式玻璃柱［29］、毛細(xì)管柱［30］，運(yùn)載氣體有氮?dú)夂秃?。樣品前處理所采取的方法與GC－MS定性分析時相同，主要包括有機(jī)溶劑提取和固相微萃取。Yoshio等［24］用GC測定烯丙基異硫氰酸酯在水解過程中的殘余量來測定烯丙基異硫氰酸酯的水解速率，所用檢測器為FPD，色譜柱為10%PEG柱填充的玻璃柱(3.2mm×3m)，柱溫180℃，進(jìn)樣口和檢測器的溫度為200℃;氮?dú)饬魉?5mL/min。而隨著色譜柱的逐漸發(fā)展，毛細(xì)管柱已經(jīng)成為目前常用的色譜柱。毛細(xì)管柱的優(yōu)點(diǎn)主要有分析效率高、分析速度快以及峰形效果好。Jalila等［30］用GC測定溶解在正己烷中的4－甲硫基－3－丁烯基－異硫氰酸酯的含量時，采用FID檢測器，色譜柱為DB－5毛細(xì)管(25m× 0.2mm)，柱溫先以70℃保持70s，然后以3℃/min速度升至170℃，檢測器溫度為250℃，運(yùn)載氣體為壓強(qiáng)180kPa的氦氣。Blazevic等［31］用GC對黑、白、紅三種品種小蘿卜的葉子和根部的揮發(fā)成分進(jìn)行定量。所用檢測器為FID，色譜柱為毛細(xì)管柱HP－101(25m× 0.2mm)，色譜條件如下:運(yùn)載氣體氦氣流速1.0mL/min，進(jìn)樣溫度250℃，檢測器溫度300℃。柱溫采用程序升溫，70℃保持 2min，然后以 3℃/min速率升到200℃，并在200℃保持15min。

在氣相色譜與質(zhì)譜檢測器聯(lián)用測定ITCs含量時，包括測定總的ITCs和單個的ITCs兩種情況。而在測定總的ITCs含量時，通常要將ITCs與1，2－苯二硫酚(1，2－BDT)環(huán)縮合反應(yīng)生成1，3－苯二硫雜環(huán)五烯－2－硫酮(1，3－BDTT)而有利于測定檢測分析。Martin等［32］首先將ITCs與1，2－苯二硫酚(1，2－BDT)環(huán)縮合，然后用GC－MS定量分析中國藥用植物萊菔子、白芥子、葶藶子、蔊菜和多種常見的蔬菜種子中的ITCs總量。

2.5.2 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)HPLC具有分析速度快、分辨率高、靈敏度高、樣品量少以及容易回收等優(yōu)點(diǎn)。目前主要應(yīng)用HPLC分析十字花科植物各部分中ITCs含量以及人們進(jìn)食十字花科植物后尿液和血漿中的ITCs含量。HPLC主要采用反相C18柱，聯(lián)接的檢測器有紫外(UV)、蒸發(fā)光散射(evaporative light scattering detector，ELSD)、光電二極管陣列(photo diode array，PAD)、質(zhì)譜(MS)。樣品前處理方法主要是化學(xué)衍生，化學(xué)試劑主要為胺類、1，2－苯二硫酚(1，2－BDT)。Lim等［33］用HPLC－ELSD法分析了蕓苔類植物樣品花椰菜中的蘿卜硫素以及Baemuchae、蘿卜中的萊菔子在不同生長時期的含量。所用色譜柱為反相C18柱。色譜條件為:柱溫40℃，流動相為水和乙腈，在15min內(nèi)乙腈濃度從0%到60%，在5min內(nèi)乙腈濃度從60%到100%并保持2min。流速為 1mL/min，進(jìn)樣量為 20μL。Luciano等［34］用HPLC－PAD法分析了烯丙基異硫氰酸酯及其水解產(chǎn)物的濃度，檢測波長為220和254nm。

在利用 HPLC測定人體尿液的 ITCs方面，Chung［35］等開發(fā)了以異硫氰酸酯和1，2－苯二硫酚(1，2－BDT)環(huán)縮化反應(yīng)產(chǎn)物1，3－苯二硫雜環(huán)五烯－2－硫酮(1，3－BDTT)為內(nèi)標(biāo)物HPLC測定方法，能較好測定人體攝入ITCs后尿液中異硫氰酸酯含量的變化。褚興棣等［36］對上述方法進(jìn)行改進(jìn)，直接用異硫氰酸丙基酯與1，2－苯二硫酚反應(yīng)產(chǎn)物作標(biāo)準(zhǔn)，省去合成1，3－苯二硫雜環(huán)五烯－2－硫酮這一步驟，該方法的檢出限(以信噪比為2.5計)達(dá)到0.08μmol/L，日內(nèi)重現(xiàn)性(n=21)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為4.7%± 2.9%，結(jié)果較為滿意。

HPLC同樣可以應(yīng)用于測定人血漿中 ITCs含量。Liebes等［37］報道了通過異硫氰酸酯與1，2－苯二硫酚(1，2－BDT)環(huán)縮化，然后利用正己烷進(jìn)行萃取，最后利用HPLC進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法線性和重復(fù)性良好。

綜上所述，將以上幾種最常用的ITCs定量分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)和適合分析范圍進(jìn)行比較，如表1所示。

3 展望

異硫氰酸酯的分析方法經(jīng)過一個多世紀(jì)的發(fā)展，取得了很大的進(jìn)展，新的分析技術(shù)不斷被應(yīng)用，GC－MS、LC－MS已逐漸成為ITCs分析的主要手段，樣品分析的準(zhǔn)確性、精確性不斷提高。這對ITCs的研究和應(yīng)用具有重要的意義。就定性分析而言，SPME、胺類衍生劑衍生等樣品前處理手段已能夠較好的滿足分析要求。但I(xiàn)TCs的定量分析中還存在一些問題有待解決。首先，采用GC技術(shù)進(jìn)行定量分析時，樣品前處理越來越多的采用SPME技術(shù)，但由于SPME對ITCs萃取的影響因素很多，其準(zhǔn)確性還有待于進(jìn)一步研究。其次，采用GC和LC對原料中ITCs定量分析時，通常均需要進(jìn)行樣品的前處理，這兩種方法的重復(fù)性、準(zhǔn)確性及精確性有待進(jìn)一步比較。

表1 ITCs定量分析方法的比較

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Methodological advances for qualitative and quantitative analysis of isothiocyanates

HU Guo－wei，YANG Ying－jie，LI Shu－yan，HU Xiao－song，LIAO Xiao－jun，ZHANG Yan*
(College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University; Key Laboratory of Fruit and Vegetable Processing，Ministry of Agriculture; Research Center of Fruit and Vegetable Processing Engineering，Ministry of Education，Beijing 100083，China)

Isothiocyanates are a kind of organic compounds with the general formula R－N=C=S.They are special flavour compounds of some cruciferous vegetables and have many biological properties.The qualitative analysis and quantitative analysis methods of Isothiocyanates were given a systemic analysis and introduction about the newly research progress.

isothiocyanates(ITCs);qualitative analysis;quantitative analysis

TS201.2

A

1002－0306(2011)12－0524－05

2010－09－29 *通訊聯(lián)系人

胡國偉(1986－)，男，碩士研究生，主要從事非熱加工技術(shù)與理論的研究。

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(30800768);國家“863”計劃重點(diǎn)課題(2007AA100405)。