仿刺參腸道多糖的純化及理化分析

林威威，張 健，王茂劍,*，常耀光，王共明

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 200000；2. 山東省海洋水產(chǎn)研究所，山東 煙臺(tái) 264006；3. 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

仿刺參腸道多糖的純化及理化分析

林威威1,2，張 健2，王茂劍2,*，常耀光3，王共明1,2

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 200000；2. 山東省海洋水產(chǎn)研究所，山東 煙臺(tái) 264006；3. 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

目的：對(duì)仿刺參腸道多糖進(jìn)行純化，并對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行理化分析。方法：使用葡聚糖凝膠(G-100)層析柱分離出兩種仿刺參腸道多糖，選取其中多糖A進(jìn)行研究。使用葡聚糖凝膠(G-100)柱層析法和瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行純度檢測(cè)，葡聚糖凝膠(G-200)柱層析測(cè)定分子質(zhì)量，高效液相色譜法確定其單糖組分，并結(jié)合紅外吸收光譜法與核磁共振對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步檢測(cè)。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)所得純化產(chǎn)物多糖A為均一組分，主要含有氨基糖醛酸、氨基半乳糖鹽酸鹽和巖藻糖3種單糖，并含有少量的氨基葡萄糖、半乳糖。其中巖藻糖有α和β兩種構(gòu)型，以α-巖藻糖硫酸酯殘基、β-巖藻糖硫酸酯殘基形式存在。分子質(zhì)量約為18.8×104D。結(jié)論：該純化產(chǎn)物多糖A為一種酸性多糖，推測(cè)其為硫酸軟骨素類(lèi)。

腸道多糖；純化；單糖分析；結(jié)構(gòu)鑒定；仿刺參

多糖是存在于自然界的醛糖和酮糖通過(guò)糖苷鍵連接在一起的多聚物，廣泛存在于各種生物體中，是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)物質(zhì)之一，在生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用。研究顯示[1]，多糖具有抗腫瘤活性、抗病毒、降血糖、抗炎、抗補(bǔ)體、抗輻射及解毒等生物活性。海參多糖是海參體內(nèi)最重要的活性物質(zhì)之一，存在于海參體內(nèi)的多糖主要分為兩類(lèi)，一類(lèi)為海參糖胺聚糖或黏多糖，另一類(lèi)為海參巖藻多糖。海參多糖的提取純化技術(shù)已較為成熟，但研究對(duì)象大多針對(duì)海參體壁。本實(shí)驗(yàn)基于對(duì)海參體壁多糖研究的較為成熟的技術(shù)，對(duì)仿刺參腸道多糖進(jìn)行提取純化研究。主要針對(duì)純化技術(shù)進(jìn)行參數(shù)確定，制備出仿刺參腸道純化多糖，對(duì)其進(jìn)行成分鑒定及結(jié)構(gòu)分析，為進(jìn)一步的功能性質(zhì)鑒定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮仿刺參腸，產(chǎn)于山東省煙臺(tái)市。

葡聚糖凝膠(Sephadex G-100)、葡聚糖凝膠(Sephadex G-200)；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(Dextran Standard 1.2×104、5 × 104、15 × 104、27 × 104D)；D-甘露糖 (Man)、D-(+)-氨基葡萄糖(GlcN)、D-氨基糖醛酸(GlcUA)、D-(+)-半乳糖醛酸(GalUA)、乳糖(Lac)、D-(+)-氨基半乳糖鹽酸鹽 (GalN)、D-半乳糖 (Gal)、L-阿拉伯糖(Ara)、L-巖藻糖 (Fuc)標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Aglient1100型高效液相色譜儀(配有ZORBAX Eclipse XDB-C18分離柱4.6mm×150mm，5μm) 美國(guó)Agilent公司；Bruker AVANCE III 600 超導(dǎo)高分辨核磁共振譜儀、Bruker TENSOR 27傅里葉紅外光譜儀 德國(guó)Bruker光公司；TU-1810PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；Hel-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；FDU-1200冷凍干燥機(jī) 日本Eyela公司；DYY-12C型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 仿刺參腸道多糖分離純化

取新鮮參腸，洗凈后用篩瀝水至無(wú)水滴下，投入組織搗碎機(jī)搗碎，勻漿。使用木瓜蛋白酶解法[2]提取，加酶量10400U/g，55℃條件下酶解6h，90℃條件下滅酶15min。將粗多糖溶液進(jìn)行減壓蒸發(fā)濃縮，取濃縮液加入1/2體積50% 的三氯乙酸(TCA)溶液，靜置過(guò)夜。再于15000r/min條件下離心15min，取上清液加入醋酸鉀使其濃度達(dá)到1.5mol/L，于4℃條件下靜置過(guò)夜，15000r/min離心15min，收集沉淀，無(wú)水乙醇洗滌，得精制腸道多糖。

精制后腸道多糖使用柱層析法[3-5]進(jìn)行純化。腸道精制多糖用蒸餾水復(fù)溶成1.5mg/mL水溶液，取2mL上樣至Sephadex G-100層析柱中，去離子水洗脫，恒定流速0.25mL/min，自動(dòng)部分收集器收集，每管2mL，共收集80管。苯酚硫酸法[6-7]檢測(cè)所收集溶液吸光度，按不同出峰分別采收，冷凍干燥得海參腸道純化多糖。

1.3.2 純度測(cè)定

采用凝膠柱層析與瓊脂糖凝膠電泳法同時(shí)檢測(cè)，凝膠柱層析法如1.3.1節(jié)中所述。

瓊脂糖凝膠電泳[8]分析：緩沖液：0.06mol/L pH8.6巴比妥緩沖液；固定劑：0.1g/100mL十六烷基三甲基溴化銨溶液；染色液：以脫色液為溶劑配制0.1g/100mL甲苯胺藍(lán)溶液；脫色液：V乙酸:V乙醇:V水＝0.1:5:5；電泳條件：200mA條件下電泳60min。

稱(chēng)取0.24g瓊脂糖加入30mL巴比妥緩沖液中，加熱制膠。將純化樣品配制成4mg/mL的溶液，取兩平行(一加溴酚藍(lán)示蹤劑，一為單樣物質(zhì))，上樣8μ L。電泳結(jié)束后固定劑中固定1h，蒸餾水沖洗膠體表面，沖洗后置于甲苯胺藍(lán)溶液中染色10min，再以脫色液漂至背景無(wú)色。

1.3.3 分子質(zhì)量測(cè)定

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將分子質(zhì)量分別為1.2×104、5×104、15×104、27×104D 的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成1mg/mL水溶液，使用Sephadex G-200色譜柱依次上柱，上樣量為1mL，去離子水洗脫，流速0.35mL/min，自動(dòng)收集器收集，苯酚硫酸法檢測(cè)，分別得各自洗脫體積Ve，27×104D洗脫體積作為外水體積Vo，以Ve/Vo為縱坐標(biāo)，lgM為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9-10]。

取純化多糖以相同條件過(guò)柱，并收集計(jì)算洗脫體積，通過(guò)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算分子質(zhì)量。

1.3.4 單糖組成測(cè)定

采用柱前衍生高效液相色譜法[11-13]。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的制備：將M a n、G l c N、GlcUA、GalUA、GalN、Gal、Ara、Fuc 8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物L(fēng)ac配制成約0.36g/L的溶液，分別吸取50μL加入試管中，然后加入450μL 0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液和等體積的0.3mol/L NaOH溶液，漩渦混勻，于70℃水浴中反應(yīng)30min，取出冷卻至室溫，用450μL 0.3mol/L HCl溶液中和，加入1mL氯仿萃取，充分振蕩，吸棄下層有機(jī)相，重復(fù)3次。將上層水相過(guò)膜，取1 0μL進(jìn)樣。

樣品制備[14]：稱(chēng)取純化樣品2.0mg于安培瓶中，加入1mL 2mol/L 三氟乙酸(TFA)，充氮?dú)夥夤?，?10℃水解8h。冷卻至室溫，5 0℃揮干TFA，逐次以2、0.3mol/L NaOH溶液緩慢調(diào)至中性，定容至1mL，取其中400 μ L并混入50 μ L內(nèi)標(biāo)物L(fēng)ac進(jìn)行PMP衍生化。具體方法同上所述。

色譜條件：Agilent 1100高效液相色譜儀，搭配ZORBAX Eclipse XDB-C18分離柱(4.6mm×150mm，5 μ m)，紫外檢測(cè)器(254nm)；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；流動(dòng)相A：15%乙腈+0.05mol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH，pH6.9)；流動(dòng)相B：40%乙腈+0.05mol/L磷酸緩沖液(KH2PO4-NaOH，pH6.9)；時(shí)間梯度：0→10→30min；濃度梯度：0→8%→20%流動(dòng)相B；進(jìn)樣體積：10μ L。

1.3.5 波譜測(cè)定

紅外光譜：采用KBr壓片法進(jìn)行紅外光譜掃描，取純化樣品1mg，與200mg KBr混合研磨，壓片后，再以傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行掃描，掃描波數(shù)范圍為4000～400cm-1。

核磁共振(NMR)：稱(chēng)取樣品50mg，0.5mL D2O溶解后，場(chǎng)強(qiáng)600MHz，上機(jī)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 仿刺參腸道組織精制多糖柱層析

仿刺參腸道組織精制多糖經(jīng)Sephadex G-100洗脫后，根據(jù)苯酚硫酸法檢測(cè)，以收集管號(hào)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖。

圖1 仿刺參腸道組織精制多糖Sephadex G-100柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution curve of purified polysaccharides from intestinal tract of Apostichopus japonicus

如圖1所示，仿刺參腸道精制多糖經(jīng)過(guò)柱層析后，產(chǎn)生兩個(gè)顯著峰A和B，兩峰無(wú)重疊無(wú)拖尾，分離效果較好。本實(shí)驗(yàn)以峰A為研究對(duì)象進(jìn)行分部收集，經(jīng)冷凍干燥后得到純化多糖A，稱(chēng)質(zhì)量后計(jì)算其提取率為0.4‰(B得率相對(duì)較少，目前仍在收集過(guò)程中)。

2.2 純度測(cè)定結(jié)果

圖2 仿刺參腸道組織純化多糖Sephadex G-100柱層析圖Fig.2 Gel column chromatography curve of polysaccharide A

如圖2所示，精制多糖經(jīng)過(guò)層析柱純化后出峰單一集中，說(shuō)明分子質(zhì)量大小屬于同一范圍的多糖被集中洗脫出來(lái)。

圖3 仿刺參腸道純化多糖瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of polysaccharide A

如圖3所示，第5與第8泳道上兩點(diǎn)均為多糖A的瓊脂糖凝膠電泳掃描，其中第5泳道上點(diǎn)為添加溴酚藍(lán)示蹤劑的平行樣，第8泳道上點(diǎn)為多糖A單物質(zhì)。兩點(diǎn)均清晰無(wú)拖尾，說(shuō)明多糖A為均一成分，純度可達(dá)到電荷均一。

圖4 葡聚糖分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 4 Calibration curve for relative molecular weight determination

2.3 分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果根據(jù)圖4標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，海參腸道純化多糖A的分子質(zhì)量約為18.8×104D。

2.4 單糖組分測(cè)定結(jié)果

圖5 單糖標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Fig. 5 HPLC of standard monosaccharides

圖6 樣品單糖組分高效液相色譜圖Fig. 6 HPLC of monosaccharides in polysaccharides A

表1 仿刺參腸道純化多糖組分分析Table 1 Monosaccharide composition analysis of polysaccharides A

結(jié)果如圖5、6及表1所示。仿刺參腸道純化多糖A主要由氨基糖醛酸、氨基半乳糖鹽酸鹽和巖藻糖等3種單糖組成，其含量分別為28.098%、23.430%、37.644%，并含有少量的氨基葡萄糖(5.988%)、半乳糖(3.181%)，微量的甘露糖和阿拉伯糖。多糖A的單糖組分與構(gòu)成海參硫酸軟骨素的單糖種類(lèi)相符[15]，因此可推測(cè)多糖A為硫酸軟骨素類(lèi)多糖。

2.5 紅外圖譜分析

圖7 純化產(chǎn)物紅外吸收光譜Fig. 7 Infrared absorption spectrum of polysaccharides A

根據(jù)參考文獻(xiàn)[16-19]分析，3447.74cm-1為－OH特征吸收峰，表明存在分子間、分子內(nèi)氫鍵，2925.22cm-1處為C—H的伸縮振動(dòng)，此兩組峰為多糖的特征峰；2000～1500cm-1是雙鍵伸縮振動(dòng)區(qū)，其中1636.34cm-1可能是C＝O的伸縮振動(dòng)峰；1500～1300cm-1區(qū)域主要提供了C－H彎曲振動(dòng)的信息；1250.11cm-1是S＝O的伸縮振動(dòng)，818.88cm-1處出現(xiàn)C－O－S拉伸振動(dòng)吸收峰，表明該糖含有硫酸酯基；1200～1000cm-1為吡喃糖環(huán)的C－O伸縮振動(dòng)所引起的，其中1165.91cm-1處為C－O－H的振動(dòng)峰，1029.70cm-1歸屬于糖環(huán)上C－O－C的伸縮振動(dòng)；963.43、928.98cm-1顯示了環(huán)的骨架振動(dòng)；902.61cm-1處可能是β-型吡喃糖環(huán)C－H變角振動(dòng)引起的。因此認(rèn)為多糖A可能為一種含硫酸酯基的β-吡喃多糖。

2.6 核磁共振分析

圖8 純化產(chǎn)物13C核磁共振圖Fig. 8 13C nuclear magnetic resonance spectrum polysaccharides A

結(jié)合參考文獻(xiàn)[18-22]，根據(jù)13C的DEPT-135°圖譜(圖8)，57 ×10-6～104×10-6范圍的碳信號(hào)表明吡喃糖的存在，δ=100以上糖信號(hào)顯示著半乳糖或巖藻糖的存在，δ=16附近信號(hào)的存在證實(shí)α-巖藻糖殘基的存在，61×10-6～81 ×10-6的信號(hào)是巖藻聚糖C2、C3、C4的信號(hào)峰，并且存在著取代基，如硫酸酯鍵或糖苷鍵。20×10-6～57×10-6是β-巖藻糖殘基上的C6的CH3信號(hào)峰，另外，巖藻糖的α構(gòu)型和β構(gòu)型在δ=100.0223、δ=101.2482、δ=104.2701也得到了體現(xiàn)。

δ=57.8254處的負(fù)峰則對(duì)應(yīng)－CH2OH基團(tuán)，推測(cè)分子內(nèi)存在半乳糖殘基，δ=175.3181表明了多糖A中含有－COOH。從DEPT-135°碳譜進(jìn)一步推測(cè)分子內(nèi)存在半乳糖殘基和半乳糖醛酸殘基。

圖9 純化產(chǎn)物1H核磁共振圖Fig. 9 1H nuclear magnetic resonance spectrum of polysaccharides A

依據(jù)氫譜(圖9)，1.1×10-6～1.2 ×10-6和3.5×10-6～5.5×10-6信號(hào)能歸屬于α-巖藻糖殘基，相對(duì)應(yīng)的δ=1.9附近的信號(hào)峰和3.5×10-6～ 5.5×10-6的信號(hào)能歸屬于β-巖藻糖殘基，δ=1.0附近信號(hào)應(yīng)為－CH3的質(zhì)子峰。該結(jié)果和碳譜的信號(hào)峰相一致。

結(jié)合紅外光譜、碳譜以及氫譜的信號(hào)綜合分析，該分子內(nèi)存在α-巖藻糖硫酸酯殘基、β-巖藻糖硫酸酯殘基、半乳糖殘基和半乳糖醛酸殘基。

3 結(jié) 論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葡聚糖G-100對(duì)純化仿刺參腸道多糖效果良好，能夠分出兩個(gè)不重疊無(wú)拖尾的多糖峰，其中純化多糖A的提取率為0.4‰，純度檢測(cè)結(jié)果證實(shí)多糖A分子質(zhì)量集中分布，具有電荷均一性。對(duì)腸道多糖A成分進(jìn)行了單糖組分分析，其中主要含有氨基糖醛酸、氨基半乳糖鹽酸鹽和巖藻糖3種單糖，還有少量的氨基葡萄糖、半乳糖，微量的甘露糖和阿拉伯糖。波譜分析結(jié)果與高效液相所檢測(cè)單糖組分相吻合，且可知多糖A中巖藻糖存在α和β兩種構(gòu)型，以α-巖藻糖硫酸酯殘基、β-巖藻糖硫酸酯殘基形式存在，為一種酸性黏多糖，推測(cè)屬于硫酸軟骨素類(lèi)。腸道多糖中另一分子質(zhì)量較小的B成分仍需繼續(xù)研究。

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Purification and Physicochemical Analysis of Polysaccharides from Intestinal Tract ofApostichopus japonicus

LIN Wei-wei1,2， ZHANG Jian2， WANG Mao-jian2,*，CHANG Yao-guang3，WANG Gong-ming1,2
(1. College of Food Science & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 200000, China；2. Marine Fisheries Research Institute of Shandong Province, Yantai 264006, China；3. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Objective: To purify and physicochemically analyze polysaccharides from the intestinal tract ofApostichopus japonicus. Methods: Two polysaccharides, named as polysaccharides A and B, respectively, were isolated and purified by using SephadexG-100 column from the intestinal tract ofApostichopus japonicus, and polysaccharide A was selected to study its physicochemical properties. Its purity was evaluated by SephadexG-100 column chromatography and agarose gel electrophoresis.The relative molecular mass was determined by Sephadex G-200 column chromatography. Monosaccharide components were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) and their structures were identifiedby infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance. Results: The purified polysaccharide A was composed of GlcUA, GalN, Fuc, and a small amount of GlcN and Gal. Fucose had two configurations including the forms ofα-fucose sulfate andβ-fucose sulfate residues. This polysaccharide had a relative molecular mass of approximately 18.8 × 104D. Conclusion: The purified polysaccharide A is an acidic polysaccharide, suggesting that it belongs to the chondroitin sulfate class.

intestinal tract polysaccharide；purification； component analysis；structure identification；Apostichopus japonicus

TS254.1

A

1002-6630(2011)17-0118-05

2011-06-30

國(guó)家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201105029)；國(guó)家海洋局海洋經(jīng)濟(jì)規(guī)劃科技推進(jìn)平臺(tái)與運(yùn)作項(xiàng)目(國(guó)海科字[2007]219)

林威威(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：742239054@qq.com

*通信作者：王茂劍(1964—)，男，研究員，本科，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：wangmaojian@126.com