空心蓮子草多糖的體外抗氧化活性

蔡凌云，周江菊，樂(lè) 利，黃國(guó)雪，王 艷，賀順美，付發(fā)瓊

(1.凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，貴州 凱里 556011；2.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637002 )

空心蓮子草多糖的體外抗氧化活性

蔡凌云1,2，周江菊1，樂(lè) 利2，黃國(guó)雪1，王 艷1，賀順美2，付發(fā)瓊2

(1.凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，貴州 凱里 556011；2.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637002 )

目的：研究空心蓮子草多糖抗氧化能力。方法：用對(duì)DPPH自由基清除率、DMPD自由基清除率和還原能力來(lái)考察不同質(zhì)量濃度的空心蓮子草多糖的體外抗氧化活性。結(jié)果：不同質(zhì)量濃度的空心蓮子草多糖的抗氧化能力不同；對(duì)DPPH自由基的EC50值為26.93mg/L(VC 47.22mg/L) ，對(duì)DMPD自由基的EC50值為73.42mg/L(VC 71.25mg/L)。結(jié)論：空心蓮子草多糖是良好的天然抗氧化劑。

空心蓮子草；多糖；抗氧化

空心蓮子草[Alternanthera philoxeroides( Mart.)Griseb]又名螃蜞菊、空心莧、水花生，革命草。為莧科(Amaranthaceae)蓮子草屬(AlternantheraForsk)植物空心蓮子草的干燥全草，該植物原產(chǎn)巴西，20世紀(jì)30年代由國(guó)外引種至我國(guó)，由于繁殖能力強(qiáng)，現(xiàn)以遍及北京、吉林、四川、湖北、湖南、廣東、福建、貴州等20多個(gè)省、自治區(qū)和直轄市，生長(zhǎng)于江、湖、河、塘、田野、水溝、荒濕地等處，自然資源極其豐富?？招纳徸硬菪晕陡屎疅o(wú)毒，具有清熱、涼血、解毒的功效，臨床上用于治療麻疹、流行性感冒、乙型腦炎、流行性出血熱等病毒性疾患?，F(xiàn)代藥理研究表明，空心蓮子草提取物具有抗流行性出血熱病毒、流感病毒、乙肝病毒、狂犬病毒、皰疹病毒等多種病毒的作用[1-2]。迄今已從蓮子草屬植物中分離鑒定的化合物類(lèi)型包括皂苷、萜、蒽醌、有機(jī)酸、甾醇、生物堿、內(nèi)酰胺、氨基酸和無(wú)機(jī)鹽等，它們的生物活性廣泛，如抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、止瀉、抗病原微生物、鎮(zhèn)痛、抗肝損傷等[3-11]。在研究空心蓮子草活性成分中發(fā)現(xiàn)：空心蓮子草多糖含量豐富，而多糖具有多種生物活性，如抗氧化活性[12-16]。開(kāi)發(fā)空心蓮子草的多糖類(lèi)物質(zhì)具有實(shí)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但空心蓮子草多糖抗氧化研究未見(jiàn)報(bào)道，因此對(duì)其多糖的抗氧化作用進(jìn)行研究，旨在為空心蓮子草的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

空心蓮子草2011年6月采集于凱里學(xué)院實(shí)驗(yàn)田邊，經(jīng)生命科學(xué)學(xué)院周江菊教授鑒定為莧科蓮子草屬植物空心蓮子草(Alternanthera philoxeroides( Mart.)Griseb)。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 日本和光純藥；N,N-二甲基對(duì)苯撐二胺(DMPD)、VC、葡聚糖 德國(guó)Ruibio公司；水為蒸餾水；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；Eppendorf Research移液器 德國(guó)Eppendorf AG公司；TU-1900雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；KQ3200DE數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；LD4-2低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)；BT124S電子天平 北京賽多利斯天平有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理和提取液制備

80℃干燥的空心蓮子草全草粉末過(guò)60目篩，置于干燥器中備用。精確稱(chēng)取上述空心蓮子草粉末10.00g，置500mL錐形瓶中，加水，料液比為1:15，超聲間歇提取2次，每次20min，功率100%，合并提取液，用Savag法反復(fù)除去蛋白，共5次。加入無(wú)水乙醇沉淀，放置在4℃冰箱冷藏過(guò)夜，于4000r/min離心10min，棄去上清液，離心后沉淀用水溶解后定容于50mL容量瓶，加入100g/L氫氧化鈉溶液100.0mL，100g/L銅試劑溶液100.0mL，沸水浴中煮沸2min，冷卻，4000r/min離心5min，棄去上清液。殘?jiān)孟礈煲合礈欤x心后棄去上清液，反復(fù)操作3次，殘?jiān)皿w積分?jǐn)?shù)10%硫酸溶液100.0mL溶解并轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。此溶液為樣品測(cè)定液。

1.3.2 多糖含量測(cè)定

含量測(cè)定采用蒽酮-硫酸法，以葡聚糖為對(duì)照品。在波長(zhǎng)626nm處測(cè)定，以葡聚糖質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其回歸方程為：A=10.425ρ+ 0.0045(r= 0.9992)。

1.3.3 還原能力測(cè)定

參照Oyaizu[17]的方法測(cè)定。取pH6.6的緩沖液和1g/100mL鐵氰化鉀溶液各2.5mL，加入不同質(zhì)量濃度的多糖溶液1mL，混勻后50℃水浴20min。加入10g/100mL三氯乙酸溶液2.5mL，混勻，4000r/min離心10min。取上清液2.5mL，加入蒸餾水和0.1g/100mLFeCl3各2.5mL，混勻，靜置10min后于700nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用不同質(zhì)量濃度的VC代替樣品重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 DPPH自由基清除率的測(cè)定

定量準(zhǔn)確量取不同質(zhì)量濃度空心蓮子草多糖溶液，依次加入2.0mL 2mmol/L DPPH溶液，搖勻，在25℃水浴加熱反應(yīng)30min，取出，測(cè)定在517nm波長(zhǎng)處的吸光度。用不同質(zhì)量濃度的VC代替樣品重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，測(cè)定吸光度。用蒸餾水代替DPPH溶液測(cè)定吸光度。用蒸餾水代替樣品和VC，測(cè)定吸光度。

1.3.5 DMPD自由基清除率的測(cè)定

10mL 100mmol/L DMPD溶液與2mL 0.1mol/L pH5.25醋酸鹽緩沖溶液混勻，加入0.2mL 0.05mol/L FeCl3，振蕩混勻，取上述溶液2mL，分別加入不同質(zhì)量濃度的多糖液和VC溶液，25℃水浴 10min。于波長(zhǎng)505nm處測(cè)定吸光度。用蒸餾水代替樣品和VC，在505nm波長(zhǎng)處的吸光度，用蒸餾水代替DMPD溶液，測(cè)定樣品和VC本底吸光度。

1.3.6 抑制質(zhì)量濃度EC50的計(jì)算

用SPSS 11.5 軟件以樣品質(zhì)量濃度與抑制率作回歸分析，根據(jù)擬合方程求出抑制率為50%時(shí)所需樣品的質(zhì)量濃度，即半抑制質(zhì)量濃度EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 空心蓮子草多糖含量的測(cè)定結(jié)果

取空心蓮子草多糖樣品測(cè)定液，在波長(zhǎng)626nm處測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算其多糖含量為6.78mg/g。

2.2 空心蓮子草多糖、VC對(duì)DPPH自由基的清除率

圖1 空心蓮子草多糖、VC對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rates of polysaccharides from APG and vitamin C at different concentrations against DPPH free radicals

經(jīng)相關(guān)性分析，空心蓮子草多糖質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.984，VC質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.988。由圖1可知，隨空心蓮子草多糖質(zhì)量濃度、VC質(zhì)量濃度的增大對(duì)DPPH自由基的清除率增強(qiáng)，但空心蓮子草多糖對(duì)DPPH自由基的清除率強(qiáng)于VC。在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，空心蓮子草多糖質(zhì)量濃度、VC質(zhì)量濃度為50mg/L時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率最高。差異性分析表明，空心蓮子草多糖質(zhì)量濃度、VC質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基清除率的影響極顯著(P＜0.01)，各質(zhì)量濃度間均具有極顯著差異(P＜0.01)。

以空心蓮子草多糖質(zhì)量濃度、VC質(zhì)量濃度與抑制率作回歸分析。空心蓮子草多糖對(duì)DPPH自由基清除率的回歸方程為：Y=1.02X＋22.53(r=0.970)。VC對(duì)DPPH自由基清除率的回歸方程為：Y=1.09X－1.47(r=0.977)?？招纳徸硬荻嗵菍?duì)DPPH自由基的EC50為26.93mg/L，VC對(duì)DPPH自由基的EC50為47.22mg/L，說(shuō)明空心蓮子草多糖的抗氧化能力強(qiáng)，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于VC，是良好的天然抗氧化劑。

2.3 空心蓮子草多糖、VC的還原能力

圖2 空心蓮子草多糖、VC的還原能力Fig.2 Reducing power of polysaccharides from APG and vitamin C at different concentrations

經(jīng)相關(guān)性分析，空心蓮子草多糖質(zhì)量濃度與還原能力的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999，VC質(zhì)量濃度與還原能力的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.994。由圖2可知，隨空心蓮子草多糖、VC質(zhì)量濃度的增大還原能力逐漸增強(qiáng)，空心蓮子草多糖的還原能力強(qiáng)于VC。在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，空心蓮子草多糖、VC質(zhì)量濃度為50mg/L時(shí)，還原能力最高。差異性分析表明，質(zhì)量濃度對(duì)空心蓮子草多糖、VC的還原能力影響極其顯著，各質(zhì)量濃度間均具有極顯著差異(P＜0.01)。

2.4 空心蓮子草多糖、VC對(duì)DMPD自由基的清除率

圖3 空心蓮子草多糖、VC對(duì)DMPD自由基的清除率Fig.3 Scavenging rates of polysaccharides from APG and vitamin C at different concentrations against DMPD free radicals

經(jīng)相關(guān)性分析，空心蓮子草多糖質(zhì)量濃度與DMPD自由基清除率的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.975，VC質(zhì)量濃度與DMPD自由基清除率的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.950。由圖3可知，隨空心蓮子草多糖、VC質(zhì)量濃度的增大對(duì)DMPD自由基的清除率逐漸增強(qiáng)。對(duì)DMPD自由基的清除作用空心蓮子草多糖與VC差異不大，略低于VC。在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，空心蓮子草多糖質(zhì)量濃度、VC質(zhì)量濃度為50mg/L時(shí)，對(duì)DMPD自由基的清除率最高。差異性分析表明，空心蓮子草多糖質(zhì)量濃度為20mg/L和30mg/L時(shí)差異不顯著(P＜0.01)，其他各質(zhì)量濃度均具有極顯著差異(P＜0.01)，VC各質(zhì)量濃度均具有極顯著差異(P＜0.01)。

以空心蓮子草多糖質(zhì)量濃度、VC質(zhì)量濃度與抑制率作回歸分析。空心蓮子草多糖對(duì)DMPD自由基清除率的回歸方程為：Y=0.5531X+9.3894(r=0.983)。VC 對(duì)DMPD自由基清除率的回歸方程為：Y=0.5009X+14.3127(r=0.989)?？招纳徸硬荻嗵呛蚔C對(duì)DMPD自由基的EC50接近，分別為73.42mg/L和71.25mg/L，說(shuō)明空心蓮子草多糖的抗氧化能力強(qiáng)，是良好的天然抗氧化劑。

3 結(jié)論與討論

3.1 自由基過(guò)多或清除自由基過(guò)慢會(huì)使生物大分子受到攻擊，會(huì)加速機(jī)體的衰老進(jìn)程，并誘發(fā)炎癥、惡性腫瘤、免疫失調(diào)等多種疾病[18]。為了抑制自由基損傷，人工合成的抗氧化劑被大量應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，化學(xué)合成制品大多有毒副作用，長(zhǎng)期攝入合成抗氧化劑可導(dǎo)致肝損傷并誘發(fā)惡性腫瘤[19]，因此從天然產(chǎn)物中尋找低毒或無(wú)毒的抗氧化有效成分具有十分重要的意義。天然多糖類(lèi)化合物對(duì)物理、化學(xué)以及生物等因素產(chǎn)生的自由基具有清除作用，有望作為天然抗氧化劑使用。

3.2 Gil等[20]用DPPH法測(cè)石榴汁、VC、和葡萄酒的總的抗氧化能力，將清除DPPH 50%所用量定義為EC50，用來(lái)作為抗氧化能力的指標(biāo)。郝曉麗等[21]用DPPH自由基清除法測(cè)定了多種植物(馬齒兌，扁蓄，車(chē)前等)的清除自由基的能力。在測(cè)定樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力時(shí)可通過(guò)計(jì)算EC50、TEC50和AE等參數(shù)來(lái)反映抗氧化劑清除自由基反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)行為。另外在酸性條件下，DMPD可被FeCl3、CuCl2、H2O2等氧化生成穩(wěn)定有顏色的DMPD自由基，它在505nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。當(dāng)加入抗氧化劑時(shí)，抗氧化劑能轉(zhuǎn)移1個(gè)氫原子給DMPD自由基，使其溶液脫色。脫色程度越強(qiáng)，說(shuō)明抗氧化劑的抗氧化能力越強(qiáng)。此反應(yīng)迅速、穩(wěn)定。所以此方法也可用來(lái)有效的篩選抗氧化劑[22]。

3.3 目前，多糖的提取分離大多采用水提醇沉的工藝。醇沉是依據(jù)分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離純化的，所以醇沉?xí)r乙醇體積分?jǐn)?shù)不同，多糖的組成和得率不同。本實(shí)驗(yàn)采用100%乙醇沉降空心蓮子草多糖。通過(guò)與公認(rèn)的抗氧化劑VC比較還原能力、對(duì)DPPH自由基、DMPD自由基的清除作用，證實(shí)了空心蓮子草多糖具有清除自由基、抗氧化的功效，是一種良好的自由基清除劑。

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Antioxidant Activityin vitroof Polysaccharides fromAlternanthera philoxeroides(Mart.) Griseb

CAI Ling-yun1,2，ZHOU Jiang-ju1，YUE Li2，HUANG Guo-xue1，WANG Yan1，HE Shun-mei2，F(xiàn)U Fa-qiong2
(1. College of Environmental and Life Science, Kaili University, Kaili 556011, China；2. Key Laboratory for Southwest Wildlife Resouces Conservation, Ministry of Education, College of Life Science, China West Normal University, Nanchong 637002, China)

Objective: To study the antioxidant activityin vitroof polysaccharides from the whole plant ofAlternanthera philoxeroides(Mart.) Griseb (APG). Methods: The antioxidant activity of polysaccharides from APG was evaluated by reducing power and scavenging capacities against DPPH and DMPD free radicals. Results: The antioxidant activity of polysaccharides from APG at various concentrations displayed an obvious difference. Compared with vitamin C, polysaccharides from APG had higher antioxidant activity. The EC50 values of polysaccharides from APG and vitamin C against DPPH free radicals were 26.93 mg/L and 47.22 mg/L, and against DMPD free radicals were 73.42 mg/L and 71.25 mg/L, respectively. Conclusion: Polysaccharides from APG is an effective and multifunctional natural antioxidant and radical scavenger so that it has potential exploitation and utilization.

Altemanthera philoxeroides(Mart.) Griseb (APG) ；polysaccharide；antioxidant activity

R284.2

A

1002-6630(2011)17-0186-04

2010-08-20

貴州省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(黔教科(2010078))；西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(XNYB-0903)；貴州省凱里學(xué)院自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(ZX1034)

蔡凌云(1972—)，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定研究。E-mail：cailingyun2005@sina.com