牛初乳乳清IgG的低溫乙醇和三聚磷酸鈉預(yù)提取技術(shù)研究

郭 斌，王志耕，2，*，孔 鵬，梅 林，2，薛秀恒，2

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥 230036；2.安徽省乳制品工程技術(shù)研究中心，安徽合肥 230000）

牛初乳乳清IgG的低溫乙醇和三聚磷酸鈉預(yù)提取技術(shù)研究

郭 斌1，王志耕1，2，*，孔 鵬1，梅 林1，2，薛秀恒1，2

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥 230036；2.安徽省乳制品工程技術(shù)研究中心，安徽合肥 230000）

探討了初乳乳清IgG的低溫乙醇法和三聚磷酸鈉法兩種預(yù)提取方法。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定了低溫乙醇法最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度30%、pH6.7、離子強(qiáng)度0.06mol/kg，IgG純度和回收率分別為39.28%、79.32%；三聚磷酸鈉法最佳工藝參數(shù)為：三聚磷酸鈉添加量0.5%、pH 4.0、溫度45℃，IgG純度和回收率分別為33.74%、82.31%。兩種方法結(jié)合超濾法作為安全有效的預(yù)提取法均可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)食品級(jí)IgG。

牛初乳，免疫球蛋白，低溫乙醇，三聚磷酸鈉

免疫球蛋白（Ig）是牛初乳中最引人注目的免疫因子，Ig總含量為50mg/mL，其中約80%～86%為免疫球蛋白G（IgG）。從功能性食品角度考慮，天然牛初乳IgG具有較廣譜的抑菌效果，特別是對(duì)導(dǎo)致胃腸道疾病的病原微生物具有良好的抑制和殺滅效果。具有活性的牛初乳IgG到達(dá)腸道后可特異性地結(jié)合、清除腸道中的致病菌，從而起到預(yù)防治療疾病的作用[1]。從牛乳中分離的IgG已成為嬰幼兒配方奶粉及其它保健品中的重要添加成分，牛IgG的含量直接決定了產(chǎn)品質(zhì)量及價(jià)格[2]。現(xiàn)代社會(huì)建立的龐大乳品工業(yè)體系已經(jīng)能夠保證牛初乳作為一種功能性食品及其制造基料的來(lái)源。超濾法是目前公認(rèn)最有前途的提取初乳IgG的工業(yè)化方法之一[3]，但牛初乳是一種成分復(fù)雜的高蛋白基料，直接超濾難免會(huì)造成嚴(yán)重的膜污染，增加超濾膜的清洗成本，降低超濾膜的壽命[4]。因此，對(duì)牛初乳進(jìn)行預(yù)處理是十分必要的。目前，低溫乙醇分離法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人血白蛋白、人血免疫球蛋白的工業(yè)化[5]，生產(chǎn)血漿IgG的低溫乙醇法可為初乳乳清中IgG的工業(yè)化提供借鑒。三聚磷酸鈉作為一種食品添加劑，通常被添加在肉類食品中用于增加產(chǎn)品的保水性，亦可以作為絮凝劑使用[6]。二者作為食品級(jí)IgG工業(yè)化制備的沉淀劑有安全無(wú)毒、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)擬研究低溫乙醇和三聚磷酸鈉在初乳乳清IgG預(yù)提取中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛初乳 采集自六安華園乳業(yè)有限公司飼養(yǎng)的無(wú)乳腺炎、分娩后3d內(nèi)的健康乳牛；牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品、羊抗牛IgG免疫血清（效價(jià)1∶32） 索來(lái)寶生物試劑公司；凝乳酶 科漢森公司；其他試劑 均為分析純。

Expert 18K-R型冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙新奧實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；pH-3B精密pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；HJ-3型控溫磁力攪拌器 江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；HH-S型恒溫水浴鍋 江蘇金壇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 初乳乳清的制備 將牛初乳經(jīng)4℃、4000r/min下離心20min脫脂后，加入0.06‰的凝乳酶，置于35℃的恒溫培養(yǎng)箱中30min，待其凝固結(jié)塊后打碎凝塊，在4℃、4000r/min下離心20min去除酪蛋白，即得到初乳乳清。

1.2.2 乙醇處理法 以乙醇作為提取沉淀劑時(shí)，影響目標(biāo)蛋白純度和回收率的主要因素有乙醇濃度、pH、離子強(qiáng)度、溫度、蛋白濃度等[7]，本實(shí)驗(yàn)選取乙醇濃度（8%、20%、25%、30%、40%，V/V）、pH（4.6、5.8、6.7、7.4、8.1）、離子強(qiáng)度（0.03、0.06、0.09、0.12、0.15mol/kg）三個(gè)因素設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)。以0.5mol/L的冰醋酸溶液和0.1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)整初乳乳清至所需的pH，取50mL乳清加入相應(yīng)體積-20℃的無(wú)水乙醇，再加入NaCl調(diào)整離子強(qiáng)度，置于4℃的冰箱中靜置2h后，4℃、4000r/min下離心20min，取沉淀用無(wú)菌PBS溶液溶解定容至50mL。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)如表1，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三組重復(fù)。

表1 低溫乙醇分離初乳乳清IgG實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.3 三聚磷酸鈉處理法 選取三聚磷酸鈉添加量（0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、1%、1.5%，W/V）、pH（3.5、4.0、4.6、5.8、6.7、7.4、8.1）、溫度（4、25、35、45、55℃）三個(gè)因素設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)。以0.5mol/L的冰醋酸溶液和0.1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)整初乳乳清至所需的pH，取50mL乳清添加不同比例的三聚磷酸鈉，分別置于不同溫度下2h后，4℃、4000r/min下離心20min，去除沉淀，取上清液[8]。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)如表2，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三組重復(fù)。

表2 三聚磷酸鈉分離初乳乳清IgG實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.4 總蛋白含量測(cè)定 采用南京建成生物工程研究所提供的蛋白定量（雙縮脲法）測(cè)試盒測(cè)定。

1.2.5 IgG含量測(cè)定 采用免疫透射比濁法[9]測(cè)定。

1.2.5.1 抗體稀釋液的配制 稱取Tris 6.21g、NaCl 4.50g、PEG 6000 25.00g、BSA 0.50g、NaN30.50g，用適量蒸餾水溶解，以1mol/L HCl溶液調(diào)整pH至7.4，定容至500mL。

1.2.5.2 IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將牛IgG標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.100、0.150、0.250、0.400、0.650、0.900、1.150、1.400、1.650、1.950mg/mL的溶液，用抗體稀釋液將羊抗牛IgG免疫血清稀釋16倍，取210μL稀釋后的抗體液與12μL標(biāo)準(zhǔn)IgG溶液混勻，37℃孵育40min，以0濃度的樣品管作為空白，在340nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 免疫透射比濁法IgG濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.5.3 樣品IgG含量的測(cè)定 取210μL稀釋后的抗體液與12μL待測(cè)樣品混勻，37℃孵育40min，以0濃度的樣品管作為空白，在340nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品IgG的濃度。

1.2.6 純度和回收率的計(jì)算

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SAS 9.1中的duncan方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇處理法

2.1.1 乙醇濃度對(duì)初乳乳清IgG純度和回收率的影響添加不同濃度乙醇的各組樣品測(cè)定IgG濃度和總蛋白濃度結(jié)果如圖2，計(jì)算IgG純度和回收率如圖3。

圖2 不同乙醇濃度對(duì)IgG濃度和總蛋白濃度的影響

圖3 不同乙醇濃度對(duì)IgG純度和回收率的影響

由圖2可以看出，IgG濃度隨著乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在乙醇濃度為25%時(shí)達(dá)到最大，之后隨著乙醇的濃度不斷增大，IgG的活性被破壞而濃度減??；而總蛋白濃度一直呈增加趨勢(shì)，主要由于乙醇降低了可溶蛋白質(zhì)的介電常數(shù)[10]，可溶性蛋白質(zhì)不斷沉淀下來(lái)。由圖3可知，IgG的純度和回收率均在乙醇濃度為25%時(shí)達(dá)到最大，分別為36.14%和65.70%。因此，乙醇濃度應(yīng)選擇為25%。

2.1.2 pH對(duì)初乳乳清IgG純度和回收率的影響 不同pH的各組樣品測(cè)定IgG濃度和總蛋白濃度結(jié)果如圖4，計(jì)算IgG純度和回收率如圖5。

圖4 不同pH對(duì)IgG濃度和總蛋白濃度的影響

圖5 不同pH對(duì)IgG純度和回收率的影響

IgG在pH3.5～7.0范圍內(nèi)相對(duì)較為穩(wěn)定[1]。由圖4可以看出，IgG濃度隨著pH的增大呈平穩(wěn)的增加趨勢(shì)，在pH8.1時(shí)達(dá)到最大，而總蛋白濃度隨著pH的增大逐漸降低，在pH為7.4時(shí)達(dá)到最小，此時(shí)可溶性蛋白的沉淀量最小，說(shuō)明初乳乳清中等電點(diǎn)處于pH7.4的蛋白質(zhì)含量較少。如圖5所示，在pH為7.4時(shí)，IgG的純度也達(dá)到最大值38.52%，回收率的變化比較平穩(wěn)，綜合考慮純度和回收率，確定pH為7.4。

圖6 不同離子強(qiáng)度對(duì)IgG濃度和總蛋白濃度的影響

圖7 不同離子強(qiáng)度對(duì)IgG純度和回收率的影響

2.1.3 離子強(qiáng)度對(duì)初乳乳清IgG純度和回收率的影響 不同離子強(qiáng)度的各組樣品測(cè)定IgG濃度和總蛋白濃度結(jié)果如圖6，計(jì)算IgG純度和回收率如圖7。

由圖6可以看出，IgG濃度隨著離子強(qiáng)度的增加逐漸增加，在離子強(qiáng)度為0.09時(shí)達(dá)到最大，之后逐漸降低；總蛋白濃度一直呈下降趨勢(shì)，但總體變化情況較為平穩(wěn)。由圖7可以看出，離子強(qiáng)度為0.12mol/kg時(shí)IgG純度達(dá)到最大值34.71%，回收率為74.27%；離子強(qiáng)度為0.09mol/kg時(shí)，IgG回收率達(dá)到最大值76.22%，純度為34.53%。綜合考慮IgG純度和回收率，選擇離子強(qiáng)度為0.09mol/kg。

2.1.4 正交實(shí)驗(yàn) 低溫乙醇分離初乳乳清IgG正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3。

表3 低溫乙醇分離初乳乳清IgG實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

表4 低溫乙醇分離初乳乳清IgG方差分析表（純度）

表5 乙醇分離初乳乳清IgG方差分析表（回收率）

由表4對(duì)IgG純度正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析表明，乙醇濃度、pH、溫度對(duì)IgG提取純度的影響均達(dá)到極顯著水平（p<0.01），各因素的影響程度為乙醇濃度>pH>離子強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)的最佳條件為A1B3C2，以此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得IgG純度為39.66%，回收率為63.41%。

由表5對(duì)IgG回收率正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析表明，pH、離子強(qiáng)度對(duì)IgG提取純度的影響均達(dá)到極顯著水平（p<0.01），乙醇濃度的影響達(dá)到顯著水平（p<0.05），各因素的影響程度為pH>離子強(qiáng)度>乙醇濃度。實(shí)驗(yàn)的最佳條件為A3B1C1，此條件下IgG純度為39.28%，回收率為79.32%。

以IgG純度和IgG回收率兩個(gè)指標(biāo)為參考對(duì)象得到的兩組最佳實(shí)驗(yàn)條件中，后者比前者在回收率提高了15.91%的情況下，純度只降低了0.38%，因此，選擇后者作為最佳工藝參數(shù)更加合適。

2.2 三聚磷酸鈉處理法

2.2.1 三聚磷酸鈉添加量對(duì)初乳乳清IgG純度和回收率的影響 添加不同三聚磷酸鈉的各組樣品測(cè)定IgG濃度和總蛋白濃度結(jié)果如圖8，計(jì)算IgG純度和回收率如圖9。

圖9 不同三聚磷酸鈉添加量對(duì)IgG純度和回收率的影響

由圖8可以看出，IgG濃度隨著三聚磷酸鈉添加量的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在三聚磷酸鈉添加量為0.1%時(shí)達(dá)到最大；總蛋白濃度呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，在三聚磷酸鈉添加量為0.4%時(shí)達(dá)到最小，三聚磷酸鈉與乳清中某些蛋白質(zhì)結(jié)合使得可溶性蛋白質(zhì)含量降低[6]。由圖9可以看出，在三聚磷酸鈉添加量為0.4%時(shí)，IgG純度為33.59%，亦為最大值。綜合回收率的變化情況，三聚磷酸鈉的添加量可確定為0.4%。

2.2.2 pH對(duì)初乳乳清IgG純度和回收率的影響 不同pH的各組樣品測(cè)定IgG濃度和總蛋白濃度結(jié)果如圖10，計(jì)算IgG純度和回收率如圖11。

圖10 不同pH對(duì)IgG濃度和總蛋白濃度的影響

由圖10可以看出，IgG濃度在pH為4.0時(shí)最大，之后隨著pH的增大不斷降低，由于IgG隨著pH的增大達(dá)到了等電點(diǎn)逐漸沉淀下來(lái)，上清液中的IgG含量降低；總蛋白濃度在pH為4.6時(shí)最大。由圖11可以看出，IgG純度在pH為4.0時(shí)最大，為31.48%，而IgG回收率此時(shí)也達(dá)到最大值，為69.61%；因此，選擇pH為4.0。

圖11 不同pH對(duì)IgG純度和回收率的影響

2.2.3 溫度對(duì)初乳乳清IgG純度和回收率的影響 不同溫度的各組樣品測(cè)定IgG濃度和總蛋白濃度結(jié)果如圖12，計(jì)算IgG純度和回收率如圖13。

圖12 不同溫度對(duì)IgG濃度和總蛋白濃度的影響

圖13 不同溫度對(duì)IgG純度和回收率的影響

由圖12可以看出，IgG濃度隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，總蛋白濃度的變化情況亦然，兩者均在溫度為35℃時(shí)達(dá)到最大，超過(guò)35℃后活性IgG含量逐漸降低。由圖13可以看出，IgG回收率在4～35℃內(nèi)逐漸升高，在35～65℃內(nèi)逐漸降低，在35℃時(shí)達(dá)到最大；IgG純度變化趨勢(shì)較為平穩(wěn)，在45℃時(shí)達(dá)到最大，之后逐漸降低。綜合純度和回收率應(yīng)選擇35℃為提取溫度。

2.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 三聚磷酸鈉分離初乳乳清IgG正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表6。

由表7對(duì)IgG純度正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析表明，pH對(duì)IgG提取純度的影響達(dá)到極顯著水平（p<0.01），三聚磷酸鈉添加量的影響達(dá)到顯著水平（p<0.05），溫度的影響不顯著。其最佳實(shí)驗(yàn)條件為A3B2C3，以此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得IgG純度為33.74%，回收率為82.31%。

由表8對(duì)IgG回收率正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析表明，三聚磷酸鈉添加量、pH和溫度三個(gè)因素對(duì)IgG回收率的影響均達(dá)到極顯著水平（p<0.01），各因素的影響程度為pH>三聚磷酸鈉添加量>溫度。其最佳實(shí)驗(yàn)條件為A3B3C3，以此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得IgG純度為30.72%，回收率為86.50%。

表6 三聚磷酸鈉分離初乳乳清IgG實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

表7 三聚磷酸鈉分離初乳乳清IgG方差分析表（純度）

表8 三聚磷酸鈉分離初乳乳清IgG方差分析表（回收率）

以IgG純度和回收率兩個(gè)指標(biāo)為參考對(duì)象得到的兩組最佳實(shí)驗(yàn)條件中，后者比前者的回收率雖然提高了4.19%，但純度卻降低了3.02%。在生產(chǎn)中，在回收率差異較小的情況下，IgG純度作為直接衡量產(chǎn)品質(zhì)量的指標(biāo)[11]應(yīng)給予優(yōu)先考慮，因此，應(yīng)選擇前者作為實(shí)驗(yàn)的最佳工藝參數(shù)。

3 結(jié)論

3.1 低溫乙醇提取初乳乳清IgG的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度為30%，pH為6.7，離子強(qiáng)度為0.06mol/kg，此時(shí)IgG純度為39.28%，回收率為79.32%。

3.2 三聚磷酸鈉提取初乳乳清IgG的最佳工藝參數(shù)為：三聚磷酸鈉添加量0.5%，pH為4.0，溫度為45℃，此條件下IgG純度為33.74%，回收率為82.31%。

3.3 兩種方法提取牛初乳IgG操作簡(jiǎn)便、安全可靠、成本低廉。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中結(jié)合超濾法進(jìn)一步提取濃縮IgG的純度可提高至56.51%，可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)食品級(jí)IgG。

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Study on pre-extraction technology of whey IgG from bovine colostrum with low-temperature ethanol and sodium tripolyphosphate methods

GUO Bin1,WANG Zhi-geng1,2,*,KONG Peng1,MEI Lin1,2,XUE Xiu-heng1,2

（1.College of Tea&Food Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China；2.Dairy Engineering Research Center of Anhui Province,Hefei 230000,China）

Two methods of pre-extraction for whey IgG from bovine colostrum with low-temperature alcohol and sodium tripolyphosphate were discussed in this test.The optimal technological parameters of low-temperature ethanol method were obtained through orthogonal tests:ethanol concentration of 30%，pH 6.7，and ionic strength of 0.06mol/kg，the purity and recovery of IgG were 39.28%and 79.32%，respectively；the optimal technological parameters of Sodium tripolyphosphate method were:Sodium tripolyphosphate addition of 0.5%，pH 4.0，temperature of 45℃，the purity and recovery of IgG were 33.74%and 82.31%，respectively.The two kinds of methods，as a safe and effective pre-extraction，combined with ultrafiltration can be applied to industrial production of food-grade IgG.

bovine colostrum； IgG； low-temperature ethanol； sodium tripolyphosphate

TS252.1

B

1002-0306（2011）10-0344-05

2010－10－12 * 通訊聯(lián)系人

郭斌（1985-），男，碩士研究生，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。