流式細(xì)胞儀的使用與維護

王淑靜 郝建民 畢建杰 常仲樂 崔言順

山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東泰安 271018

流式細(xì)胞儀的使用與維護

王淑靜 郝建民 畢建杰 常仲樂 崔言順

山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東泰安 271018

介紹了流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)、工作原理及軟件的主要功能，在儀器的維護保養(yǎng)方面進行了詳細(xì)地敘述。結(jié)合筆者工作實際，介紹了用流式細(xì)胞儀對雞外周血淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果。

流式細(xì)胞儀；流動室；細(xì)胞分選系統(tǒng)；淋巴細(xì)胞

Abstract: This article describes the structure of f ow cytometry, how it works and the main functionality of the software, in the area of maintenance of the instrument are described in detail. In conjunction with our own actual work, the author analyzed the results by f ow cytometric peripheral blood lymphocyte subsets in chicken.

Key words: f ow cytometry; mobile off ce; cell sorting system; lymphocyte

EasyCyte Mini Guava流式細(xì)胞儀,適用于各種流式細(xì)胞學(xué)檢測分析,如動物、昆蟲、酵母、原代培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、懸浮和貼壁細(xì)胞以及熒光微球等。采用固態(tài)藍色或綠色激光,四色、三色或兩色熒光檢測,前向散射檢測,可選配側(cè)向散射；有自沖洗系統(tǒng),保證流動通路暢通。EasyCyte Mini Guava流式細(xì)胞儀采用微毛細(xì)管流動技術(shù),無需鞘液,特別適合于傳染性危險生物樣品的分析,山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病防治重點實驗室主要用于細(xì)胞絕對計數(shù),CD4/CD8細(xì)胞計數(shù),免疫細(xì)胞分析,細(xì)胞標(biāo)記蛋白表達檢測如GFP等。結(jié)合筆者多年使用該儀器的工作經(jīng)驗,對流式細(xì)胞儀的工作原理、使用與維護介紹如下：

1 流式細(xì)胞儀的主要構(gòu)造和工作原理

流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的高科技,它集計算機技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體,同時具有分析和分選細(xì)胞的功能。它不僅可測量細(xì)胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測細(xì)胞表面和細(xì)胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA含量等,可對群體細(xì)胞在單細(xì)胞水平上進行分析,在短時間內(nèi)檢測分析大量細(xì)胞,并收集、儲存和處理數(shù)據(jù),進行多參數(shù)定量分析；能夠分類收集(分選)某一亞群細(xì)胞,在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。

(1)流式細(xì)胞儀主要由5部分構(gòu)成：流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)；激光光源及光束形成系統(tǒng)；光學(xué)系統(tǒng)；信號檢測與存儲、顯示、分析系統(tǒng)；細(xì)胞分選系統(tǒng)。

(2)流式細(xì)胞儀工作原理（如圖1所示）。

圖1 流式細(xì)胞儀工作原理

2 儀器軟件的主要功能

Guava流式細(xì)胞儀的主軟件是CytoSoft,用于控制儀器、獲取細(xì)胞和分析數(shù)據(jù),相當(dāng)于一個操作平臺。在此操作平臺上共有10個分析模塊用于具體的實驗：

(1)Express分析軟件,所有的流式實驗都可以使用這個軟件來獲取細(xì)胞和分析數(shù)據(jù),用戶有更大的自主控制權(quán),包括設(shè)置參數(shù)、多色熒光的補償、設(shè)“門”、選擇點圖或直方圖,可以根據(jù)實驗的具體情況來設(shè)計。Guava EasyCyte Mini配Express Plus軟件。(2)Viacount分析軟件：用于活細(xì)胞計數(shù),可以檢測每單位體積內(nèi)活細(xì)胞的含量和死細(xì)胞的含量,為后續(xù)實驗取用的樣品量提供依據(jù),也可以監(jiān)測細(xì)胞的生長狀態(tài)。(3)Nexin分析軟件：用于細(xì)胞凋亡的分析。(4)MultiCaspase分析軟件：用于細(xì)胞凋亡的分析。(5)Tunel分析軟件：用于細(xì)胞凋亡的分析。(6)Mitopotential分析軟件：用于細(xì)胞凋亡的分析。(7)Cell Cycle分析軟件：用于細(xì)胞周期的分析。(8)Cell Paint分析軟件：考察被熒光標(biāo)記的活細(xì)胞在反應(yīng)體系中的分布。(9)Cell Toxicity分析軟件：用于細(xì)胞毒性分析實驗,分別給出效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞在反應(yīng)體系中的變化。(10)CellGrowth分析軟件：用于細(xì)胞增殖分析實驗,可以考察5代細(xì)胞的數(shù)量。我們主要使用(1)(2)(7)3個分析軟件。

3 EasyCyte Mini Guava流式細(xì)胞儀保養(yǎng)與維護

(1)在每天實驗結(jié)束后和實驗過程中(當(dāng)樣品很多時),按規(guī)定運行“Quick Clean”“Clean”或“Clean & Shutdown”,防止液流通路的阻塞。當(dāng)樣品是血樣或其他直接來自動物組織的細(xì)胞樣品,雜質(zhì)較多的時候樣品要先過濾,并在實驗過程中適當(dāng)增加清洗的次數(shù)。為了徹底清洗液流系統(tǒng),每天實驗結(jié)束需要運行2遍清洗和關(guān)機程序。在清洗結(jié)束后,始終保留一個去離子水管在Guava PCA上。

(2)當(dāng)懷疑液流通路被堵塞或封閉時,可以在每個實驗界面或Guava Check界面,點擊Backflush(倒沖)按鈕,為避免污染未檢測的樣品,需要移開上樣管中的樣品管。移除樣品管,裝載上20%漂白劑。Backflush結(jié)束后,加入1管去離子水,點擊“Quick Clean”。如果在運行Guava Check時進行Backf ush,直接用水倒沖系統(tǒng)。

(3)用注射式洗滌工具清洗流動室。移出流動室時,操作要小心。一定不要碰觸毛細(xì)管,其易碎。千萬不要將流動室裝置用力放入底座中。在試圖移出流動室前,為了避免暴露于激光輻射中,要關(guān)閉Guava PCA電源。

(4)每打開一個Guava程序應(yīng)使激光器預(yù)熱5分鐘。

(5)建議每次實驗進行Check beads檢測,確保儀器參數(shù)在正常范圍,若較長時間沒有使用該儀器,必須先進行Check beads檢測,以確保系統(tǒng)運行正常。

(6)勿將Guava的ICF,Bleach(漂白劑,5%次氯酸鈉)或其他清潔劑放在EasyCyte Mini儀器中過夜或時間過長。長時間暴露在強氧化劑中會損傷毛細(xì)管。

(7)當(dāng)清洗瓶中的ICF只有1/4瓶時,需要在清洗瓶中加入ICF。清洗液通過瓶中的管子進行吸取。不要使清洗瓶空置,這會導(dǎo)致流動池中有氣泡產(chǎn)生,需要重新用水沖洗系統(tǒng)。

(8)關(guān)機時記住在EasyCyte Mini儀器中放置1管去離子水。定時更換裝水的管子。

(9)每天實驗結(jié)束或需要時,要倒空廢液瓶。

4 應(yīng)用實例

淋巴細(xì)胞是正常機體免疫系統(tǒng)功能最重要的一大細(xì)胞群,在免疫應(yīng)答過程中,末梢血淋巴細(xì)胞發(fā)育成為功能不同的亞群,各亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時,就能導(dǎo)致機體免疫紊亂并產(chǎn)生病理變化。FCM可以通過對不同的淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的測定來監(jiān)控病體的免疫狀態(tài),指導(dǎo)治療。圖2和圖3是FCM測定雞外周血淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果。

圖2

圖3

圖2是雞外周血淋巴細(xì)胞亞群的前向散射光(FS)和側(cè)向散射光(SS)組成的點陣圖,根據(jù)forward scatter與side scatter確定待檢測的淋巴細(xì)胞門。

圖3為用anti-CD4Mab-FITC和anti-CD8Mab-PE對所選淋巴細(xì)胞進行標(biāo)記后的淋巴細(xì)胞分群(左上：CD4 T細(xì)胞亞群；右下：CD8 T細(xì)胞亞群)。此二維點陣圖是細(xì)胞的2種熒光(FITC和RD1)雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示,橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)均是對數(shù)的,橫坐標(biāo)代表FITC,縱坐標(biāo)代表PE,圖中已設(shè)定適當(dāng)?shù)摹伴T”(十字門)。

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Use and maintenance of f ow cytometry

Wang Shujing, Hao Jianmin, Bi Jianjie, Chang Zhongle, Cui Yanshun Shandong agricultural university, Tai'an, 271018, China

2011-01-07 稿件編號：1101022

王淑靜,碩士,實驗師。通訊作者：崔言順,教授,動科學(xué)院黨委書記,國家級實驗教學(xué)示范中心主任。

國家自然科學(xué)基金項目(編號：30671498)，國家“十一五”科技支撐項目(編號：2006BAD04B01)。