急性肺損傷大鼠肺組織基質金屬蛋白酶2及其抑制因子蛋白和mRNA的表達

阮 瓊，蘇中昊，楊愛東，李文雯，汪東穎，吳中華，龐慧芳

(1.上海市第八人民醫(yī)院急診內科，上海 200233;2.上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，上海 201203)

急性肺損傷大鼠肺組織基質金屬蛋白酶2及其抑制因子蛋白和mRNA的表達

阮 瓊1，蘇中昊2，楊愛東2，李文雯2，汪東穎2，吳中華2，龐慧芳2

(1.上海市第八人民醫(yī)院急診內科，上海 200233;2.上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，上海 201203)

目的 探討內毒素致急性肺損傷(ALI)大鼠肺組織核轉錄因子-κB(NF-κB)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)及其抑制因子(TIMP-2)蛋白和mRNA表達的變化。方法 20只雄性Wistar大鼠隨機分為2組：對照組、LPS模型組，每組再分為4 h和8 h兩個亞組。尾靜脈注射脂多糖(LPS)(10 mg/kg)建立大鼠急性肺損傷模型。檢測血白細胞計數、支氣管肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量，采用免疫組化ABC法和實時熒光定量PCR分別測定肺組織NF-κB、MMP-2、TIMP-2蛋白及其mRNA的表達，并觀察肺組織病理變化。結果 與對照組相比，模型組4 h和8 h時大鼠肺組織中的NF-κB、MMP-2蛋白染色陽性面積率及其 mRNA表達均顯著增高(P＜0.01)、TIMP-2蛋白染色陽性面積率及其mRNA表達均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。病理學觀察顯示，模型組大鼠肺組織出現出血及壞死。結論 內毒素致急性肺損傷的發(fā)病機制可能與NF-κB、MMP-2蛋白及其mRNA表達升高、TIMP-2蛋白及其mRNA表達降低有關。

脂多糖;急性肺損傷;NF-κB;MMP-2;TIMP-2

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是心源性以外的各種肺內外致病因素導致的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭，以呼吸困難、難治性低氧血癥和非心源性肺水腫為臨床特征，嚴重的ALI或ALI的最終嚴重階段被定義為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)［1］，研究表明，核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)及其抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP-2)在內毒素致急性肺損傷的發(fā)病中有重要作用。本實驗通過建立內毒素致ALI模型，觀察大鼠肺組織 NF-κB、MMP-2、TIMP-2蛋白及其 mRMA表達的變化，為揭示急性肺損傷的發(fā)病機制提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級Wistar雄性大鼠20只，體重(220±20)g，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供［SCXK(滬)2007-005］。專用標準顆粒飼料、水喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑

LPS：購自美國 Sigma 公司(LPS：O111：B4，批號 L-2630);NF-κBp65(NLS)：sc-114 購自美國 Santa Cruz生物技術公司;大鼠MMP-2和TIMP-2免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;大鼠 NF-κB、MMP-2、TIMP-2和GAPDH引物和探針序列由廣州達輝生物技術有限公司合成，序列分別為：NF-κB：上游引物：5′-CTACACCGAAGCAATTGAAGTGA-3，下 游 引物：5′-CAGCGAGTGGGCCTGAGA-3，探針序列：5′-AGGCAGCCTCCAGCCCAGTGA-3，5′端 FAM 修飾;3′端 Tamra 修飾;MMP-2：上游引物： 5′-CCC ATG AAG CCT TGT TTA CCA-3′，下 游 引 物：5′-TGG AAG CGG AAC GGA AAC T-3′，探 針 序 列：5′-TGGCAATGCTGATGGACAGCC-3′，5′端 FAM 修飾，3′端 Tamra 修飾;TIMP-2：上游引物：5′-CTC ATC GCG GGC CGT TTA AG-3，下游引物：5′-GAA GGC TTC GGG TCA TCG AG-3′，探 針 序 列：5′-CATGGAGAGCCTCTGTGGAT-3′，5′端 FAM 修飾，3′端 Tamra 修飾;GAPDH：上游引物：5′-CCG AGG GCC CAC TAA AGG-3，下 游引物：5′-GCT GTT GAA GTC ACA GGA GAC AA – 3，探針序列：5′-CATCCTGGGCTACACTGAGGACCA-3，5′端 FAM 修飾，3′端Tamra修飾。Trizol總 RNA提取試劑、反轉錄和PCR擴增所需的酶及其他試劑均購自美國Invitrogen公司。

1.3 動物模型與分組

按隨機數字表將大鼠隨機分為對照組、模型組，再隨機分為4 h、8 h兩個亞組(每組5只)。模型組經尾靜脈注射LPS(10 mg/kg)復制急性肺損傷大鼠模型［2，3］，正常組注入等容積生理鹽水。

1.4 動物標本制備

所有動物均于設定的相應時相點(造模后4 h和8 h)，用烏拉坦1.0 g/kg腹腔麻醉，分離大鼠腹主動脈，取一次性5 mL注射器從大鼠下腔靜脈抽取靜脈血約1 mL注入肝素鈉抗凝管中，混勻后進行白細胞計數檢測。取血后解剖大鼠頸部，暴露氣管，抽取生理鹽水灌洗支氣管，取離心后的支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid，BALF)，用考馬斯亮蘭法測定蛋白濃度;開胸分離右肺上葉用10%甲醛溶液固定，用于病理檢測及肺組織NF-kB、MMP-2和TIMP-2蛋白免疫組化檢測;右肺下葉置于液氮罐中作 NF-kBmRNA、MMP-2mRNA和 TIMP-2mRNA表達檢測。

1.5 免疫組織法檢測肺組織 NF-κBp65、MMP-2及TIMP-2蛋白含量

采用IMS細胞圖像分析系統(tǒng)醫(yī)學圖像分析軟件，對免疫組織化學結果進行圖像采集和定量分析。每張切片在高倍鏡下隨機選擇不相重疊的3個視野，細胞核為藍色，NF-κBp65、MMP-2及 TIMP-2陽性細胞為棕黃色。計算出每例樣本的蛋白染色陽性面積率(蛋白染色陽性面積率 =陽性細胞面積/總面積)作為比較參數。

1.6 實時熒光定量PCR檢測肺組織NF-κBmRNA、MMP-2mRNA及TIMP-2mRNA的表達

按Trizol法提取總RNA后，逆轉錄合成 cDNA，在20 μL的反應體系中分別加入樣本RNA2 μg全文統(tǒng)一，RT buffer(5 × )4 μL，10mmoldNTPs 1 μL，N9 隨機引物 1 μL，逆轉錄酶 MMLV 1 μL，RNA 酶抑制劑1 μL，0.1 mol/LDTT2 μL，加 DEPC 處理水到 20 μL，混勻后于下列溫度反應：37℃1 h;95℃5 min，滅活MMLV，產物即為cDNA。PCR擴增：在50 μL反應體系中加入 cDNA 5 μL，ddH2O 水 32 μL，PCR buffer(5 × )10 μL，熒光探針 0.5 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，dNTPs 0.5 μL，TNF-α 上下游引物各0.5 μL，擴增條件：(1)93℃ 2 min(2)93℃ 45 s 55℃ 1 min，10 cycle(3)93℃ 30 s，55℃ 45 s，30 cycle。

擴增產物分析：數據采用儀器自帶軟件ABI Prism 7300 SDS Software分析。NF-κBmRNA、MMP-2 mRNA及TIMP-2mRNA表達水平以它們與GAPDH的相對表達量來計算。

1.7 肺組織病理學觀察

制備肺組織標本，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理改變。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0軟件包分析統(tǒng)計，所有數據均采用均數±標準差(±s)表示，多組均數采用單因素方差分析，組間兩兩比較用 LSD檢驗，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠血白細胞計數及支氣管肺泡灌洗液蛋白含量比較

與對照組相比，模型組4 h和8 h時白細胞計數明顯降低(P＜0.05或 P＜0.01)，肺泡灌洗液的蛋白含量明顯升高(P＜0.01)。(見表1)

表1 兩組大鼠血白細胞計數及支氣管肺泡灌洗液蛋白含量比較 (n=5)Tab.1 Comparison of blood white blood cell count and protein content in BALF between the two groups(n=5)

2.2 大鼠肺組織NF-κB、MMP-2及 TIMP-2蛋白染色陽性面積率的比較

與對照組相比，模型組 4 h和 8 h時 NF-κB P65、MMP-2蛋白染色陽性面積率均明顯升高(P ＜0.01);TIMP-2蛋白染色陽性面積率明顯降低(P＜0.01)(見表2)。

表2 兩組大鼠肺組織NF-κB、MMP-2及TIMP-2蛋白染色陽性面積率的比較 (n=5)Tab.2 Comparison of expression of NF-κB ，MMP-2 and TIMP-2 protein dyeing positive rate of area in lung tissues between the two groups(n=5)

2.3 大鼠肺組織 NF-κB、MMP-2及 TIMP-2mRNA表達的比較

與對照組相比，模型組 4 h和 8 h時 NF-κB、MMP-2mRNA表達均顯著增高(P＜0.01)，TIMP-2mRNA表達均明顯降低(P＜0.05)。(見表3)

2.4 大鼠肺組織病理學改變

光鏡觀察：對照組大鼠肺表面呈淡紅色，結構完整，肺泡隔均勻一致，組織小葉結構清晰，纖維結締組織無增生，肺泡腔清晰可見，肺泡壁無增厚，支氣管粘膜上皮完整，肺泡腔細支氣管腔未見明顯炎細胞及滲出物。模型組4 h與8 h時大鼠肺泡腔內充滿炎性滲出物和出血，肺泡壁毛細血管擴張充血，細支氣管粘膜上損傷部分脫落，管壁上大量淋巴細胞浸潤，管壁增厚，可見肺不張，肺氣腫(彩插3見圖1)。

3 討論

MMP-2屬于明膠酶的一種，亦稱明膠酶 A，MMP-2以無活性酶原的形式由多種細胞分泌，如成纖維細胞、巨噬細胞、內皮細胞等，在激活劑的作用下轉變?yōu)槌墒斓拿?，其作用底物?IV、V型膠原。MMP-2激活與表達后，能降解基底膜的主要成分IV膠原，使基底膜變薄甚至斷裂，引起血管通透性增加、炎癥細胞浸潤，蛋白外滲，肺泡內液體增多、肺間質和肺泡水腫形成，甚至出現肺出血等。MMP-2是所有MMPs中分布最廣的，當細胞惡變或損傷時，常有MMP-2的升高［4］。研究表明，正常肺組織中MMP-2呈弱表達，而脂多糖(LPS)和前炎癥細胞因子(如 TNF-α)能促進 MMP-2 的表達［5］。本實驗顯示，正常對照組MMP-2 mRNA表達很低，靜脈注射內毒素后，MMP-2在轉錄水平的表達增高，此實驗結果與先前研究結果一致。

TIMPs是一組內源性特異性抑制MMPs活性的糖蛋白，其與 MMPs形成 1∶1復合體而抑制其活性［6］。TIMP-2是 MMP-2的特異性抑制蛋白，特異性抑制MMP-2的活性。在正常肺組織中，細胞外基質的合成和降解保持動態(tài)平衡，這對于保證正常肺功能非常重要［7］。MMPs和 TIMPs的平衡被破壞時，肺泡上皮基底膜被破壞之后可導致肺泡上皮細胞受損，富含蛋白和蛋白酶的水腫液充滿肺泡，使表面活性物質滅亡。此外，基底膜完整性受到破壞后，各種損傷因子易于進入肺間質和肺泡腔，加重肺間質和實質損傷，進而引起肺功能障礙，導致肺泡萎陷和頑固性低氧血癥［8］。

研究表明，轉錄因子 NF-κB在某些 MMP、TIMP基因啟動子上有某些特異性結合位點，當細胞外信號激活這些轉錄因子后即可誘導MMP、TIMP表達。NF-κB可跨膜激活 P53，間接誘導 MMP-2的轉錄;激活的NF-κB又可反饋上調 IL-6，TNF-α等促炎因子進一步影響 MMPs 表達［9，10］。

本實驗結果表明，模型組大鼠肺組織出現出血及壞死，提示造模成功。與對照組相比，模型組大鼠肺組織中的NF-κB、MMP-2蛋白及其 mRNA表達均顯著增高(P＜0.01)、TIMP-2蛋白及其 mRNA表達均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。提示內毒素致急性肺損傷的發(fā)病機制可能與 NF-κB、MMP-2蛋白及其 mRNA表達升高、TIMP-2蛋白及其 mRNA表達降低有關。

表3 兩組大鼠肺組織NF-κB、MMP-2及TIMP-2 mRNA表達的比較 (n=4)Tab.3 Comparison of expression of NF-κB ，MMP-2 and TIMP-2 mRNA in lung tissues between the two groups(n=4)

［1 ］ Bernard GR，Artigas A，Brigham KL，et al.The American-Europe An Consensus Conference on ARDS： Definitions，mechanisms，relevant outcomes，and clinical trial coordination［J］.Crit Care Med，1994，149(1)：818-824.

［2 ］ Kao SJ，Wang D，Lin HI，et al.N-acetylcysteine abrogates acute lung injury induced by endotoxin［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2006，33(1 ～ 2)：33-40.

［3］ 林英，朱曦，和宇，等.頸脊髓切斷對內毒素血癥大鼠急性肺損傷的影響［J］.中國危重病急救醫(yī)學，2008，20(10)：621-624.

［4］ Ries C， Petrides PE. Cytokine regulation of matrix metalloproteinase activity and its regulatory dysfunction in disease［J］.Biol Chem Hoppe Seyler，1995，376(6)：345-355.

［5］ Coimbra R，Melbostad H，Loomis W，et al.LPS-induced acute lung injury is attenuated by phosphodiesterase inhibition：effects on proinflammatory mediators，metalloproteinases，NF-kappaB，and ICAM-1 expression［J］.J Trauma，2006，60(1)：115-125.

［6 ］ Davidson B，Goldberg I，Kopolovic J，et al.MMP-2 and TIMP-2 expression correlates with poor prognosis in cervical carcinoma-a c1inicopatho1ogic study using immunohistochemistry and mRNA in situ hybridization ［J］.GynecolOncol，1999，73(3)：372-382.

［7 ］ Ohbayashi H.Matrix metalloprotrinases in lung diseases［J］.Curr Protein Pept Sci，2002，3(4)：409-421.

［8 ］ Ricou B，Nicod L，Lacraz S，et al.Matrix metalloproteinases and TIMP in acute respiratory distress syndrome［J］.Am J Respir Crit Care Med，1996，154(2 Pt 1)：346-352.

［9］ Bond M，Fabunmi RP，Baker AH，et al.Synergistic upregulation ofmetalloproteinase-9 by growth factors and inflammatory cytokines：an absolute requirement for transcription factor NFKappaB［J］.FEBS Lett，1998，435(1)：29-34.

［10］ Han YP，Tuan TL，Hughes M，et al.Transforming growth factorbeta-and tumor necrosis factor-alpha-mediated induction and proteolytic activation of MMP-9 in human skin［J］.J Biol Chem，2001，276(25)：22341-22350.

Expression of the MMP-2 and TIMP-2 Protein and Its mRNA in Rats with Acute Lung Injury Caused by Lipopolysaccharide

RUAN Qiong1，SU Zhong-hao2，YANG Ai-dong2，LI Wen-wen2，WANG Dong-ying2，WU Zhong-hua2，PANG Hui-fang2
(1.Department of Emergency Medicine，Shanghai Eingth People's Hospital，Shanghai 200233，China;2.The Basic Medicine College of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China)

Objective To investigate the changes of NF-κB，MMP-2 and TIMP-2 protein and its mRNA in the rats with acute lung injury(ALI)caused by lipopolysaccharide(LPS).Methods Twenty male Wistar rats were randomly divided into two groups： normal control group，LPS model group.Each group had two subgroups，4 hours and 8 hours after LPS were injected.The ALI model was established by intravenous injection of LPS(10 mg/kg)through a tailvein.Then the white blood cell(WBC)in blood and the protein content in bronchial alveolar lavage fluid(BALF)were measured，the expressions of nuclear factor-κB(NF-κB) ，matrixmetalloproteinase-2(MMP-2) and tissueinhibitorofmatrix metalloproteinases(TIMP-2)protein in pulmonary tissues were measured by immunohistochemistry ABC，the expression NF-κB ，MMP-2 and TIMP-2mRNA were measured by real-time fluorescent polymerase chain reaction(PCR) ，while the histopathology of the lung injury was observed by light microscope.Results Compared with normal group，the expression of NF-κB and MMP-2 protien dyeing positive rate of area and its mRNA in LPS model group were obviously increased at 4 hours and 8 hours(P＜0.01) ，and the expression of TIMP-2 protein dyeing positive rate of area and its mRNA at 4 hours and 8 hours were obviously decreased in LPS model group(P＜0.05or P＜0.01).Light microscope observation indicatedthat there were pulmonary hemorrhage and necrosis in model group.Conclusion The increasing of expression NF-κB and MMP-2 protein and its mRNA and the decreasing of expression TIMP-2 protein and its mRNA may be the mechanism of ALI caused by LPS.

Lipopolysaccharide;Acute lung injury;NF-κB;MMP-2;TIMP-2

R563.9 R332

A

1671-7856(2011)03-0039-04

2010-08-26

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.010

上海市教委高校高水平特色發(fā)展項目(No.(2005)81);上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項基金(P13908)。

阮瓊(1969-)，女，主治醫(yī)師，主要從事急診醫(yī)學臨床與實驗研究。

楊愛東，副教授，碩士生導師，主要從事中醫(yī)藥防治急性肺損傷的分子機制研究。aidongy@126.com。