金黃色葡萄球菌致小鼠慢性輸卵管炎性不孕模型制作

徐桂中，張 欣，侯一平，劉向文

(1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)研究所神經(jīng)生物學(xué)研究室，蘭州 730000;2.武漢市中心醫(yī)院急診科，武漢 430012)

金黃色葡萄球菌致小鼠慢性輸卵管炎性不孕模型制作

徐桂中1，2，張 欣1，侯一平1，劉向文1

(1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)研究所神經(jīng)生物學(xué)研究室，蘭州 730000;2.武漢市中心醫(yī)院急診科，武漢 430012)

目的 通過金黃色葡萄球菌直接感染小鼠輸卵管，建立炎癥致不孕的動物模型。方法 用1×109/mL的金黃色葡萄球菌接種小鼠，制作慢性輸卵管炎癥模型，觀察輸卵管病理炎性改變以及小鼠的受孕情況。結(jié)果 造模術(shù)75 d后，模型組小鼠受孕率、輸卵管通暢率顯著低于對照組(P＜0.001)。模型組肉眼觀察輸卵管有不同程度積水積膿、僵硬，輸卵管與周圍組織均有不同程度的粘連;病理學(xué)觀察輸卵管管腔被異物肉芽組織完全阻塞，全層均見大量慢性炎細(xì)胞浸潤。結(jié)論 輸卵管內(nèi)接種濃度1×109/mL的金黃色葡萄球菌可以成功建立小鼠輸卵管炎性不孕模型。

金黃色葡萄球菌;小鼠;輸卵管炎;模型;不孕

臨床發(fā)現(xiàn)，隨著流產(chǎn)手術(shù)操作增加以及各種原因引起的盆腔炎癥的增多，慢性輸卵管炎性狹窄、阻塞致不孕癥占女性不孕的1/3［1］。為了建立慢性輸卵管炎性不孕癥的動物模型，作者采用濃度1×109/mL的金黃色葡萄球菌接種小鼠雙側(cè)輸卵管成功制作了慢性輸卵管炎性不孕模型，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 動物

清潔級昆明雌性小鼠30只，雄性小鼠6只，60日齡，體重為25±3 g，均購于蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心［SCXK(甘)20050007，合格證號 0000285］。在蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)研究所動物房分籠飼養(yǎng)，溫度20℃ ～28℃，光暗周期12 h。將雌性小鼠隨機分為兩組，其中造模組15只，正常對照組15只。

1.2 細(xì)菌懸液的配制

金黃色葡萄球菌［ATCC25923］，用無菌生理鹽水稀釋，配成濃度約為1×109/mL的致病菌懸液。菌種由甘肅省疾病預(yù)防控制中心提供，由蘭州大學(xué)微生物研究所培養(yǎng)。

1.3 儀器

光鏡：OlympusbhsCH-2，中國產(chǎn)。

1.4 模型制作方法

健康小鼠分別稱重，參考趙廣興［2］的細(xì)菌接種方法，用無水乙醚麻醉小鼠，將小鼠仰臥固定，腹部剃毛備皮，酒精消毒，鋪巾，于恥骨聯(lián)合向上約0.5 cm處作縱形切口，長約1.5 cm，用眼科手術(shù)器械打開腹腔，暴露Y形子宮，沿子宮找到雙側(cè)輸卵管，分別在子宮角近輸卵管處進針，向輸卵管-卵巢方向緩慢注射。對照組：注入生理鹽水0.02 mL，模型組：注射細(xì)菌懸液0.02 mL。注射完畢后，用眼科小鑷夾閉子宮角1 min，手術(shù)盡量避免損傷其他組織，分層關(guān)腹，消毒術(shù)區(qū)，鋪無菌墊料。術(shù)后第45 d后分別放入雄性小鼠3只，75 d后觀察受孕情況并分別選取3只小鼠進行病理學(xué)觀察。

1.5 觀察項目與方法

1.5.1 觀察受孕情況：

造模術(shù)后第45 d，每5只造模小鼠中放入1只同種成熟雄性小鼠。以同籠飼養(yǎng)30 d后為限，分別觀察受孕情況。

1.5.2 肉眼觀察：

觀察輸卵管與周圍組織有無粘連，有無積水、化膿等。

1.5.3 觀察輸卵管通暢程度：

在子宮-輸卵管交界處進針，向輸卵管-卵巢方向注射5%美藍(lán)溶液約3 mL，同時捏緊子宮側(cè)，觀察輸卵管通暢程度，分為管腔通暢和不通暢。

1.5.4 觀察病理改變：

選取輸卵管，置于10%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察病理改變。

1.5.5 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)方法：

用SPSS 10.0軟件進行四格表X2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 小鼠受孕情況

造模術(shù)后第75 d受孕情況見下表1，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，P＜0.001，兩組具有顯著性差異，模型組小鼠受孕率明顯低于對照組。

表1 兩組小鼠受孕成功率的比較(n=15)Tab.1 Comparison of the success rate of pregnancy with two groups of mice(n=15)

2.2 肉眼觀察變化

對照組15只小鼠，輸卵管均無積水及積膿，與周圍組織無粘連。與對照組相比，模型組12只小鼠的輸卵管有不同程度的積水積膿，輸卵管傘端與周圍組織均有不同程度的粘連;3只小鼠輸卵管僵硬，壺腹部與周圍組織輕度粘連。

2.3 輸卵管通暢情況

正常組與模型組通暢情況，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗P ＜0.001，兩組具有顯著性差異，模型組小鼠輸卵管通暢率明顯低于對照組(表2)。

表2 兩組小鼠輸卵管通暢率的比較 (n=15)Tab.2 Comparison of the patency rate of tubal with two groups of mice(n=15)

2.4 光鏡觀察病理改變

對照組3只小鼠輸卵管壁組織結(jié)構(gòu)清晰，黏膜上皮呈柱狀，有纖毛(圖1、2)。與正常組相比，模型組3只小鼠管腔被異物肉芽組織完全阻塞，纖維組織明顯增生，血管擴張充血，管腔部分阻塞;全層均見大量慢性炎細(xì)胞浸潤，主要為淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及少量酸性粒細(xì)胞等慢性炎性細(xì)胞浸潤(圖3、4、5)。

圖1 正常小鼠輸卵管管壁，組織結(jié)構(gòu)清楚，管腔通暢，細(xì)胞排列緊密。HEFig.1 Normal mouse oviduct wall，clear organizational structure，the lumen patency，tightly packed cell.HE

圖2 正常小鼠輸卵管黏膜上皮有較多纖毛，黏膜形成許多皺褶。HEFig.2 Normal mouse oviduct epithelium has more cilia and the formation of many folds of mucous membrane.HE

3 討論

輸卵管具有運送卵子，攝取卵子及將受精卵運送到子宮腔的作用，因而任何影響輸卵管功能的因素均可導(dǎo)致不孕。慢性輸卵管炎是不孕的主要原因之一。機制研究表明，輸卵管病理上出現(xiàn)炎癥的滲出，發(fā)生積水、積膿、粘連;久之，產(chǎn)生纖維疤痕，管壁變硬、增厚，從而導(dǎo)致輸卵管狹窄、阻塞，妨礙精卵的通過而造成不孕［3］。

圖3 造模第75 d小鼠輸卵管管壁，黏膜皺褶明顯減少。HEFig.3 Seventy-five days later，mucosa fold decreased in mouse oviduct wall.HE

圖4 造模75 d小鼠輸卵管黏膜纖毛柱狀上皮變成矮柱狀，固有層可看到血管擴張、充血。HEFig.4 Seventy-five days later，mouse oviduct has low columnar ciliated columnar epithelium in mucosa，vascular dilation and congestion in lamina propria.HE

圖5 造模75 d小鼠輸卵管黏膜層，可見炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主。HEFig.5 Seventy-five days later，mouse oviduct mucosa shows infiltration of inflammatory cells，mainly lymphocytes.HE

在科研實驗中，慢性輸卵管炎致不孕的動物模型所選擇的動物及致炎劑各不相同。國內(nèi)黃河玲［4］等用苯酚膠漿劑注射兔制作慢性輸卵管炎模型;國內(nèi)李祥云等［5］用β溶血性鏈球菌制作兔輸卵管阻塞模型;劉麗［4］等用混合菌金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌等制作大鼠輸卵管不孕模型。國內(nèi)外大 多 選 用 大鼠［2，4］，兔［5～7］及 猴［8］等 大型動物，在制作及飼養(yǎng)費用、制作難度相對小鼠來說較高。

同時，上述模型制作與臨床病例不夠接近，臨床中術(shù)后輸卵管炎多數(shù)是由于革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌感染所致。本實驗用金黃色葡萄球菌制作輸卵管炎癥模型更貼近臨床，選用小鼠制作輸卵管炎癥模型有利于臨床科研的進行;而且采用的金黃色葡萄球菌，在實踐中較易獲取，培養(yǎng)較容易，能為研究慢性輸卵管炎性不孕提供可靠的動物模型。

致謝：本研究得到蘭州大學(xué)微生物研究所雒艷萍老師、人體解剖與組織胚胎學(xué)研究所周媛媛等給予的支持和幫助!

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Modeling Chronic Salpingitis Infertility with Staphylococcus aureus in Mice

XU Gui-zhong1，2，ZHANG Xin1，HOU Yi-ping1，LIU Xiang-wen1
(1.Laboratory of Neurobiology，Department of Anatomy，Histology and Embryology.School of Basic Medical Sciences，LanZhou University，LanZhou 730000，China;2.Emergency Department of WuHan Central Hospital，WuHan 430014，China)

Objective To establish infertile animal model through inflammation by directing infection mouse oviduct with staphylococcus aureus.Methods Directing inoculation concentration of 1×109/mL of staphylococcus aureus into mice tube，making the model of chronic inflammation in the fallopian tube，observing the pathological inflammatory changes and pregnancy of mice.Results Seventy-five days later，mouse pregnancy rates and tubal patency rate in model group were significantly lower than control group(P ＜ 0.001).In model group，the tubes had different degrees of dropsy，empyema and rigid tube had different levels of adhesion with surrounding tissue by visual observation.The fallopian tube lumen was completely obstructed by foreign granulation tissue and the whole layer was full of a large number of chronic inflammatory cell infiltrations by pathological observation.Conclusion That the concentration of 1×109/mL of Staphylococcus aureus were inoculated could successfully establish a mouse model of salpingitis infertility.

Staphylococcus aureus;Mouse;Salpingitis;model;Infertility

Q492.6 R332

A

1671-7856(2011)03-0006-04

2010-06-25

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.002

徐桂中(1979-)，男，研究方向：中藥治療輸卵管炎性不孕的基礎(chǔ)研究。

徐桂中，E-mail：xujie19982003@yahoo.com.cn。