Na N3誘變“邯7086”后代變異研究及變異系的SSR分析

謝淑芹,張希太,張彥波,肖磊

（邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)中心,河北邯鄲056001）

利用基因突變改良品種是小麥遺傳改良的重要途徑之一.化學(xué)誘變具有成本低廉、使用方便、誘變作用專一等特點(diǎn),是一種發(fā)展迅速的育種手段,近年來國內(nèi)外利用化學(xué)誘變育成的農(nóng)作物品種數(shù)量明顯增加[1].近半個(gè)世紀(jì)以來,各國學(xué)者曾試用了許多化學(xué)物質(zhì)來篩選有效低毒的化學(xué)誘變劑,疊氮化鈉（NaN3）是為數(shù)不多的能應(yīng)用于植物化學(xué)誘變的高效低毒的化學(xué)誘變劑之一,疊氮化鈉易誘發(fā)植物基因的點(diǎn)突變且對人畜無致癌副作用,近年來疊氮化鈉在應(yīng)用于小麥、大麥、水稻等誘變育種方面取得了明顯的效果[2-5].為了創(chuàng)造新的小麥品種資源并且探討疊氮化鈉對小麥誘變處理的適宜方法,進(jìn)行了疊氮化鈉誘變小麥“邯7086”的研究.

1 材料與方法

1.1 材料

疊氮化鈉為天津南開大學(xué)化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的分析純產(chǎn)品,“邯7086”種子為本院小麥研究室贈送.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子處理 采用磷酸緩沖系統(tǒng),緩沖液的pH值為3.0；疊氮化鈉為0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L 5種濃度處理,每種疊氮化鈉濃度處理分為2個(gè),誘變時(shí)一個(gè)處理用氣泵鼓入空氣,另一個(gè)不鼓入空氣.具體操作為：當(dāng)年的9月下旬,選飽滿的“邯7086”種子,每個(gè)處理1 000粒,裝入小尼龍袋中,封緊口并懸掛記錄標(biāo)簽,先將10個(gè)種子處理袋在室溫下用自來水浸泡10 h,待種子吸足水分胚開始萌動時(shí)分別浸入裝有各種疊氮化鈉濃度處理液的燒杯中,用氣泵向相應(yīng)的燒杯中鼓入空氣,在室溫下連續(xù)處理3 h,取出種子袋用自來水反復(fù)沖洗后按不同處理播入試驗(yàn)田中,并調(diào)查出苗率.第2年小麥成熟時(shí)按不同處理收割脫粒并保存M0代種子.第2年小麥播種時(shí),從各處理的M0代種子中隨機(jī)選取3 000粒,按處理單穴單粒播種,第3年小麥?zhǔn)崭钋罢{(diào)查各處理的變異情況,并選擇優(yōu)良單株,以后每年均按株系單穴單粒播種,并逐年淘劣選優(yōu)直到獲得穩(wěn)定的株系.

1.2.2 穎苞內(nèi)滴加 疊氮化鈉溶液的配制同1.2.1.在小麥的抽穗揚(yáng)花期,選大部分小花正在揚(yáng)花的“邯7086”的麥穗作為誘變材料,在揚(yáng)花后2 h開始整穗,去掉尚未開放的小花,在穎片內(nèi)剪去羽毛狀柱頭,立即用微量注射器滴加10～20 μL疊氮化鈉溶液于切口處,套袋并掛標(biāo)簽標(biāo)記.4 h后復(fù)滴1次,每個(gè)濃度處理50穗.

小麥成熟后按不同處理分別收獲脫粒后保存M0代種子.當(dāng)年的9月底在大田中,將不同處理的M0種子分小區(qū)單穴單粒播種,并調(diào)查出苗率.第2年小麥成熟收割前調(diào)查各處理的變異株率,變異類型等.然后選優(yōu)良的變異單株,脫粒按株系保存M1代種子.以后每年按株系單穴單粒播種,并逐年選擇直到獲得穩(wěn)定的株系.

1.2.3 生長點(diǎn)注射 疊氮化鈉溶液的配制同1.2.1.在小麥的起身拔節(jié)期,在生長健壯的小麥植株上選擇大的分蘗用微量注射器沿著葉鞘扎入到分蘗的生長點(diǎn)部位,注射約20～30 μL疊氮化鈉溶液到生長點(diǎn)部位,將注射后的分蘗掛標(biāo)簽記錄.隨后的逐年選擇過程同1.2.2.

1.2.4 穗莖注射 疊氮化鈉溶液的配制同1.2.1.在小麥抽穗期,選擇尚未揚(yáng)花的“邯7086”麥穗作為誘變材料,用微量注射器將不同濃度的疊氮化鈉溶液注射到穗莖的腔內(nèi),每莖約注射30～50 μL,每個(gè)濃度處理50穗.隨后的逐年選擇過程同1.2.2.

1.3 穩(wěn)定變異株系的SSR分子標(biāo)記檢測

1.3.1 模板DNA的提取 采用SDS法并參照文獻(xiàn)[6]的方法從樣品小麥暗培養(yǎng)的黃花麥芽中提取DNA,純化后取少量的樣品溶于無菌的超純水中制成濃度約為20 ng/μL的模板液.

1.3.2 PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建與引物的選擇 根據(jù)Roder發(fā)表[7-8]的SSR引物,隨機(jī)選取分布于各對染色體上的SSR引物45對,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.PCR反應(yīng)采用25 μL體系,其中TaqDNA 聚合酶 5U（0.2 μL）,DNA 模板液 0.5 μL,上下游引物各 1 μL,25 mmol/L MgCl22 μL,2.5 mmol dNTP 1 μL,10×buffer 2.5μL,無菌超純水16.8 μL,礦物油15 μL.PCR反應(yīng)在英國TECHNE公司生產(chǎn)的TC-5000PCR儀上進(jìn)行,反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min,94℃變性50 s,50℃退火50 s,72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5 min,4℃保存.

1.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,每泳道上樣量為8 μL,在200 V恒電壓下電泳2.5 h,剝膠,銀染,照相,進(jìn)行擴(kuò)增條帶的分析.

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同疊氮化鈉濃度、不同誘變處理方法對M 0代種子發(fā)芽率的影響

表1 各種處理M0代種子發(fā)芽率

表1數(shù)據(jù)顯示,疊氮化鈉溶液誘變的小麥種子,隨著疊氮化鈉濃度的提高,對種子的生理損傷加大,M0代種子的發(fā)芽率迅速下降.種子誘變處理時(shí)用氣泵鼓入空氣的處理,M0代種子的發(fā)芽率明顯高于不鼓入空氣的處理,這是因?yàn)椴还娜肟諝馓幚淼男←湻N胚除受到誘變劑疊氮化鈉的損傷外,還受到了無氧呼吸帶來的傷害,盡管無氧呼吸的損傷在0 mmol/L濃度疊氮化鈉處理時(shí)表現(xiàn)不明顯,但在含有疊氮化鈉的各處理中卻表現(xiàn)十分明顯,使處理種子的發(fā)芽率明顯降低.據(jù)田間調(diào)查,用疊氮化鈉溶液誘變處理的小麥種子,大田播種后出苗明顯推遲,長出的麥苗明顯細(xì)弱,生長發(fā)育緩慢,部分弱苗在越冬時(shí)死亡.

由表1可知,用穎苞內(nèi)滴加、生長點(diǎn)注射和穗莖注射這3種方法誘變處理的M0代種子的發(fā)芽率幾乎不受疊氮化鈉的影響,其原因可能是在種子發(fā)育的早期,受疊氮化鈉毒害嚴(yán)重的子房、合子、早期的胚胎都未能發(fā)育成種子而夭折,受誘變劑損傷較輕或未受損傷的子房、合子、早期的胚胎才發(fā)育成了健康的種子,所以它們的M0代種子的發(fā)芽率幾乎都為100%,穎苞內(nèi)滴加、生長點(diǎn)注射、穗莖注射3種誘變方法處理的“邯7086”M0代種子,播種后出苗、生長發(fā)育都很正常.

2.2 不同疊氮化鈉濃度、不同誘變處理方法對M 1代種子變異率的影響

表2 各種處理M1代群體變異率

由表2可見,疊氮化鈉誘變種子的處理M1代群體植株的變異率明顯高于穎苞內(nèi)滴加、生長點(diǎn)注射、穗莖注射3種方法.且隨著疊氮化鈉濃度的提高M(jìn)1代群體的變異率也提高.種子誘變處理時(shí)用氣泵鼓入空氣的處理,M1代群體的變異率明顯高于不鼓入空氣的處理,且不鼓入空氣的處理M1代群體隨疊氮化鈉濃度增加變異率提高幅度減小.分析原因,種子誘變時(shí)鼓入空氣處理的小麥種子受無氧呼吸的損傷較小,有較多的受疊氮化鈉損傷較嚴(yán)重的種子得以存活,而在不鼓入空氣的處理中無氧呼吸和誘變劑疊同時(shí)對種子造成損傷,使得受疊氮化鈉損傷較嚴(yán)重的種子不能存活,因此鼓入空氣處理的M1代群體變異率高于不鼓入空氣的處理.

穎苞內(nèi)滴加和生長點(diǎn)注射兩種誘變方法,當(dāng)疊氮化鈉濃度較低（0.5 mmol/L）時(shí)沒有誘變效果,只有疊氮化鈉濃度大于1 mmol/L時(shí),M1代群體中才出現(xiàn)少量的變異,且變異率隨疊氮化鈉濃度的提高增幅不大.分析原因,在穎苞內(nèi)滴加誘變時(shí),由于疊氮化鈉溶液中的-N3-1需要通過極細(xì)的花粉管才能到達(dá)胚囊中影響合子或早期的胚胎細(xì)胞,由于花粉管內(nèi)徑的限制盡管提高了滴加的疊氮化鈉濃度,可是能到達(dá)胚囊中的疊氮化鈉溶液的量是有限的,所以其誘變率較低,M1代群體的誘變率隨疊氮化鈉濃度提高變化不大；生長點(diǎn)注射誘變時(shí),雖然疊氮化鈉溶液直接注射到了生長點(diǎn)部位但注入的量較少,生長點(diǎn)部位被誘變的細(xì)胞也較少,這些被誘變的細(xì)胞在分化過程中又只有很少一部分形成生殖細(xì)胞,所以其M1代群體變異率很低.

穗莖注射疊氮化鈉溶液的誘變方法,沒有效果.這從疊氮化鈉誘變植物的原理中不難得到解釋,疊氮化鈉本身沒有誘變作用,它的誘變作用是在植物細(xì)胞內(nèi)通過半胱氨酸合成酶代謝產(chǎn)生的,半胱氨酸合成酶能利用疊氮化鈉溶液中的-N3-1合成β-疊氮丙氨酸,而β-疊氮丙氨酸才能作用于細(xì)胞的基因組DNA使其發(fā)生變異.穗莖注射時(shí)疊氮化鈉接觸的是穗莖部位的細(xì)胞,沒有接觸穗部的生殖細(xì)胞,所以在其后代中沒有變異產(chǎn)生.

2.3 不同疊氮化鈉濃度、不同誘變處理方法的M1代群體變異類型

表3 各種處理M1代群體變異類型

表3顯示,種子處理（Ⅰ、Ⅱ）的M1代群體變異類型豐富,和對照相比主要性狀變異表現(xiàn)在株高、葉片蠟質(zhì)層的有無、芒的有無、穗型的改變、成熟期長短、同時(shí)還出現(xiàn)了不能成活的葉綠素缺失的白化與黃化株以及不能正常繁殖后代的不育株；穎苞內(nèi)滴加、生長點(diǎn)注射（Ⅲ、Ⅳ）兩種誘變方法處理的M1代群體變異率低,變異類型不豐富,僅出現(xiàn)了矮桿植株、葉片無蠟質(zhì)層植株、不育株、和葉綠素缺失株.

從M1代開始對變異群體淘劣優(yōu)選優(yōu),從M3代已經(jīng)開始有穩(wěn)定的變異系出現(xiàn).經(jīng)過多代的選擇我們已經(jīng)從疊氮化鈉誘變“邯7086”的變異系統(tǒng)中選出多個(gè)各具特色的穩(wěn)定種質(zhì)系,其中Ym fl-23、Ym fl-42、Ymfl-46綜合農(nóng)藝性狀好,品比產(chǎn)量超對照.為了從分子水平上說明疊氮化鈉對“邯7086”的誘變效果,對“邯7086”、Ymfl-23、Ymfl-42、Ymfl-46進(jìn)行了SSR分子標(biāo)記檢測.

2.4 疊氮化鈉誘變“邯7086”變異種質(zhì)系的SSR分子標(biāo)記檢測結(jié)果

SSR分析采用的引物為：xgwm4、xgwm5、xgwm6、xgwm43、xgwm44、xgwm46、xgwm52、xgwm107、xgwm120、xgwm135、xgwm140、xgwm148、xgwm155、xgwm160、xgwm179、xgwm194、xgwm213、xgwm219、xgwm257、xgwm260、xgwm261、xgwm268、xgwm272、xgwm293、xgwm294、xgwm295、xgwm297、xgwm301、xgwm304、xgwm311、xgwm328、Xgwm334、Xgwm339、xgwm357、xgwm400、xgwm408、xgwm428、xgwm437、xgwm469、xgwm493、xgwm499、xgwm614、xgwm617、xgwm642、xgwm645.其中 xgwm148（圖1）、xgwm304（圖2）、xgwm645（圖3）檢測出了和“邯7086”不同的多態(tài)性DNA片段.

圖1 引物xgwm148檢測結(jié)果

圖2 引物xgwm304檢測結(jié)果

圖3 引物xgwm645檢測結(jié)果

3 小結(jié)與討論

（1）疊氮化鈉是一種高效且對哺乳類動物無毒害作用的植物化學(xué)誘變劑,本試驗(yàn)結(jié)果表明,疊氮化鈉對小麥有較強(qiáng)的誘變效應(yīng),能夠使小麥在株高、蠟質(zhì)層、芒型、穗型、葉綠素、育性、生育期等方面發(fā)生性狀變異.在0～2.0 mmol/L濃度范圍內(nèi)隨著疊氮化鈉濃度的提高對小麥的誘變效應(yīng)增強(qiáng).

（2）在本試驗(yàn)采用的誘變處理方法中,用pH值3.0的疊氮化鈉溶液處理種子并同時(shí)鼓入空氣的處理方法處理后種子出苗率高,后代性狀變異類型豐富,變異率高,是適合小麥誘變處理的一種切實(shí)可行的好方法.

（3）通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測“邯7086”、Ymfl-23、Ymfl-42、Ymfl-46的基因組DNA,從分子水平上證明了疊氮化鈉對小麥的誘變效果.

（4）利用疊氮化鈉進(jìn)行化學(xué)誘變的方法是創(chuàng)造小麥新種質(zhì)、選育小麥新品種的有效途徑之一,在擴(kuò)大遺傳變異、加速提高育種效率、改進(jìn)育種方法方面有著很大發(fā)展?jié)摿?

[1]王琳清,陳秀蘭,柳學(xué)余.小麥突變育種學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2004：35-88.

[2]李社榮,王琳清,施巾幗.疊氮化鈉處理預(yù)輻照冬小麥適宜方法的研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)1991,5（2）：65-71.

[3]張超美.疊氮化鈉對小麥的誘變效應(yīng)[J].湖北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1994,14（3）：96-60．

[4]曹欣,楊煜峰,錢強(qiáng)華.疊氮化鈉對不同大麥品種的誘變效應(yīng)[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1991,3（3）：143-146.

[5]彭紹民.疊氮化鈉誘變水稻生物學(xué)效應(yīng)研究[J].湖北省作物學(xué)會會刊,1987（1）：21-23.

[6]王關(guān)林,方宏筠.植物基因工程原理與技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社,1998：598-599.

[7]Roder M S,Plaschke J,Konig S U,et al.Abundance,variability and chromosomal location ofmicrosatellites in wheat[J].Mol Gen Genet,1995,246（3）：327-333.

[8]Roder M S,Korzun V,Wendehake K,et al.Amicrosatellite map ofwheat[J].Genetics,1998,149（4）：2007-2023.