發(fā)酵酒中T-2毒素污染調(diào)查分析及其風(fēng)險評估

賴心田 張世偉 藍(lán)迪曦 陳薇 楊國武

(深圳市計量質(zhì)量檢測研究院 廣東深圳 518131)

發(fā)酵酒中T-2毒素污染調(diào)查分析及其風(fēng)險評估

賴心田 張世偉 藍(lán)迪曦 陳薇 楊國武

(深圳市計量質(zhì)量檢測研究院 廣東深圳 518131)

本研究建立了啤酒、葡萄酒中T-2毒素免疫學(xué)檢測的前處理方法。該方法采用氯仿提取,檢出限為0.2ng/mL,回收率為89.7%-101.3%。并首次對市場上啤酒和葡萄酒的T-2毒素污染水平進(jìn)行了調(diào)查。在對深圳市民膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查的基礎(chǔ)上,對啤酒和葡萄酒的T-2毒素污染進(jìn)行了風(fēng)險評估,結(jié)果顯示這兩種產(chǎn)品風(fēng)險較低。

T-2毒素;啤酒;葡萄酒;風(fēng)險評估

1 前言

T-2毒素是鐮刀菌所產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素中毒性最強(qiáng)的一種,其主要產(chǎn)毒菌為擬技孢鐮刀菌(Fusarium sporotrichioides)。T-2毒素具有明顯的細(xì)胞毒性,對蛋白質(zhì)、DNA的合成有抑制作用。T-2毒素主要污染小麥、大麥、黑麥、玉米等谷物及制品,對人類健康及畜牧業(yè)構(gòu)成了極大危害。目前,主要對大麥、玉米、小麥、稻米、高粱等農(nóng)作物進(jìn)行T-2毒素的監(jiān)測。我國對T-2毒素的監(jiān)測結(jié)果顯示,面粉、玉米粉中污染比較嚴(yán)重,大米情況較好[1,2]。

啤酒素有“液體面包”的美稱,營養(yǎng)豐富、老少皆宜;葡萄酒更因具有軟化血管、保護(hù)心臟、抗癌、調(diào)節(jié)血壓、美容養(yǎng)顏等功效倍受大眾喜愛;發(fā)酵酒是農(nóng)作物的下游加工制品,如果原料中含有T-2毒素,則T-2毒素極有可能帶入酒中。然而,對啤酒、葡萄酒等發(fā)酵酒產(chǎn)品,還沒有見到T-2毒素殘留調(diào)查的報道。免疫學(xué)檢測因其快速、靈敏、簡便、高通量被大量應(yīng)用于真菌毒素的監(jiān)控。本研究對發(fā)酵酒中T-2毒素免疫學(xué)檢測的提取方法進(jìn)行了摸索,并用建立的方法調(diào)查了市場上啤酒、葡萄酒中T-2毒素的含量,在對深圳市民膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查的基礎(chǔ)上,對發(fā)酵酒中T-2毒素進(jìn)行了風(fēng)險評估。

2 材料與方法

2.1 試劑與樣品

T-2毒素免疫學(xué)檢測試劑盒為Romer公司產(chǎn)品;T2毒素標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司產(chǎn)品;葡萄酒19份,啤酒27份,從深圳市場購買。

2.2 方法

2.2.1 樣品前處理

量取5.0mL樣品加入125mL分液漏斗中,加入20mL氯仿混合,加塞振搖5min,靜置分層,收集下層氯仿溶液于100mL的蒸發(fā)皿中。再在加入20.0 mL氯仿于分液漏斗中,重復(fù)振搖萃取2次,將氯仿萃取液并入同一個蒸發(fā)皿中,65℃水浴通風(fēng)揮干。揮干冷卻后,加入1.0mL70%甲醇溶解備用。

2.2.2 方法驗證

將T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液(100μg/mL)用70%甲醇水稀釋至所需濃度。為測試試劑盒的線性范圍與檢出限,配制0、0.125、0.250、0.500、1.00、3.75、7.50、15.0、30.0、60.0、100、500、1000ng/mL系列濃度的T-2毒素溶液,用酶標(biāo)法測定每孔的光密度值(波長450nm)。通過陰性啤酒、葡萄酒樣品不加標(biāo)和加標(biāo)回收實驗驗證提取方法的可靠性和穩(wěn)定性,加標(biāo)濃度為1ng/mL、50ng/mL和200 ng/mL。

2.2.3 風(fēng)險評估方法

向深圳市民隨機(jī)發(fā)放問卷,對調(diào)查問卷回收后進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果

3.1 方法驗證

通過相關(guān)性分析,方法的線性范圍為1-1000 ng/mL(R2=0.9974),檢出限為0.2ng/mL。分別對5個UPLC-MS/MS法[3]證明為陰性的葡萄酒和啤酒樣品進(jìn)行檢測,未發(fā)現(xiàn)假陽性。加標(biāo)回收實驗結(jié)果見表1,葡萄酒和啤酒樣品中T-2毒素的添加回收率分別為100.0%、93.8%。說明該方法準(zhǔn)確可靠,能滿足調(diào)查的要求。

表1 檢測方法的添加回收率

3.2 樣品測試

從19份葡萄酒中檢出11份,檢出率為57.9%,污染程度在0-1.67ng/mL(見表2),平均0.4152ng/mL;從27份啤酒中檢出9份,檢出率為33.3%,污染程度在0-0.67ng/mL(見表3),平均0.4152ng/mL。

表2 市場上葡萄酒中T-2毒素污染水平調(diào)查結(jié)果

表3 市場上啤酒中T-2毒素污染水平調(diào)查結(jié)果

3.3 風(fēng)險評估

3.3.1 深圳居民膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查

深圳是個新興城市,人口結(jié)構(gòu)復(fù)雜,居民來自全國各地,其膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查分析數(shù)據(jù)可視為全國的一個縮影,對全國居民膳食結(jié)構(gòu)研究有一定參考價值。本調(diào)查選取了不同年齡階段、不同行業(yè)的各類人群作為調(diào)查對象,針對深圳市居民個人膳食結(jié)構(gòu)做出調(diào)查分析,為進(jìn)一步的食品安全風(fēng)險評估系統(tǒng)提供有利證據(jù)。本次調(diào)查隨機(jī)向人群共發(fā)放106份調(diào)查表,實際收回52份,以下數(shù)據(jù)均以52人計算。被調(diào)查者年齡跨度為20-80歲,其中男女比例為1:1.3,其中20-30歲有22人,30-40歲有10人,40-50歲有12人,50歲以上8人,人群具有一定的代表性,年齡分布比較均勻,便于對整體膳食結(jié)構(gòu)全面分析。被調(diào)查的行業(yè)包括制造業(yè)、IT電子、檢驗、新聞、化工、服務(wù)業(yè)、綠化、個體戶、金融保險、學(xué)生、美術(shù)等,涵蓋了深圳各主要行業(yè)。

調(diào)查結(jié)果顯示,深圳市居民每人每周攝入葡萄酒范圍在0-1000mL(大多數(shù)在5-250mL)之間,每人每周攝入葡萄酒平均量為76mL,每人每天攝入量平均為10.9mL。深圳市居民每人每周攝入啤酒范圍在0-2500mL(大多數(shù)在0-250mL)之間,每人每周攝入啤酒平均量為322mL,每人每天攝入量平均為46.1mL。

3.3.2 深圳市民攝入T-2毒素人均日暴露水平

葡萄酒污染T-2毒素的平均水平為0.4152 ng/mL,人均每日消費(fèi)10.9mL,啤酒污染T-2毒素的平均水平為0.1759 ng/mL,人均每日消費(fèi)46.1 mL。據(jù)此計算,深圳居民每天從葡萄酒和啤酒中攝入T-2毒素的量分別為4.52ng和8.11ng。

3.3.3 風(fēng)險描述

2001年JECFA第56次會議,將T-2毒素的PMTD I(暫定每日耐受最大攝入量)定為60ng/kg.bw。以成人60kg體重計算,每人每天攝入T-2毒素的安全閾值為3600ng。而對深圳居民膳食結(jié)構(gòu)調(diào)查顯示深圳居民每天從葡萄酒和啤酒中攝入T-2毒素的量分別為4.52ng和8.11ng,遠(yuǎn)低于安全閾值。考慮到因個體、性別、年齡、職業(yè)的差異,飲酒量有所不同,某些人群飲酒量可能較大。但即便飲酒量超過平均值的100倍,攝入T-2毒素的量仍低于3600ng的安全閾值。因此,從目前的數(shù)據(jù)分析,食用葡萄酒和啤酒導(dǎo)致T-2毒素影響身體健康的風(fēng)險較低。

目前,我國還沒有T-2毒素的衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn),前蘇聯(lián)已提出國家的食品衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)為100ng/mL。從檢測結(jié)果看,市場上發(fā)酵酒中T-2毒素污染水平均遠(yuǎn)低于100ng/mL,在安全范圍內(nèi)。

4 討論

T-2毒素難溶于水,易溶于極性有機(jī)溶劑,溶于二氯甲烷和氯仿,微溶于石油醚,性質(zhì)穩(wěn)定,室溫下放置6-7h或加熱至200℃1-2h毒力仍無減弱,而堿性條件下次氯酸鈉可使其失去毒性。

目前,對T-2毒素的調(diào)查研究都主要集中在糧食和飼料等初級加工產(chǎn)品。GB/T5009.118-2008制定了谷物中T-2毒素的檢測方法,高效液相色譜法和免疫法的檢測限分別為10μg/kg和1μg/kg,但未見發(fā)酵酒的檢測方法。Romero等人采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法首次對發(fā)酵酒中T-2毒素進(jìn)行檢測[3]。其檢測限達(dá)到0.02ng/mL,但其提取過程較為復(fù)雜,不適合于大規(guī)模調(diào)查性試驗。免疫學(xué)檢測方法操作簡單,并且研究技術(shù)日趨成熟,被廣泛用于真菌毒素的市場調(diào)查和風(fēng)險監(jiān)測[4-5]。真菌毒素的免疫學(xué)檢測方法的前處理過程一般分為兩種:直接提取法和萃取法。米面等糧食作物主要采用直接提取法。直接提取法一般使用甲醇、乙腈等極性較大的有機(jī)溶劑。曹艷紅等人用70%甲醇溶液提取大米、面粉等樣品中的T-2毒素,回收率可達(dá)到85%-117.5%[6]。若在發(fā)酵酒中直接加入甲醇水或乙腈溶液,甲醇水或乙腈溶液會與樣品互溶,因發(fā)發(fā)酵酒成分復(fù)雜,直接進(jìn)行EL ISA檢測,結(jié)果會有干擾。因此對發(fā)酵酒這類基質(zhì)復(fù)雜的樣品,必須采用萃取法。本研究在提取T-2毒素時,首先考慮用極性小的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取。在葡萄酒T-2毒素的提取過程中曾使用乙酸乙酯及石油醚。乙酸乙酯結(jié)果提取液呈淺紅色,是葡萄酒中的紅色素溶于乙酸乙酯,造成樣品本底高,回收率也異常增加,基質(zhì)干擾明顯。由于T-2毒素微溶于石油醚,石油醚提取的回收率并不理想。本研究參照了Suga等人用乙酸乙酯-甲醇(95:5)的提出方法[7],同樣基質(zhì)干擾非常明顯,因而改用氯仿萃取。在用氯仿溶劑萃取時,會不同程度的乳化現(xiàn)象發(fā)生,操作不當(dāng)會影響提取效率。為避免此現(xiàn)象,在加氯仿溶液前應(yīng)先除去啤酒中的CO2,并加大氯仿用量和萃取次數(shù)。有時在兩液相之間可能會出現(xiàn)絮狀物,要避免混絮狀物進(jìn)入氯仿層中。

產(chǎn)生T-2毒素的鐮刀菌是在田間感染農(nóng)作物并產(chǎn)生毒素,因此加強(qiáng)作物的田間管理對預(yù)防真菌污染很有幫助。此外,對作物的收割采摘、貯藏、運(yùn)輸及加工過程實行標(biāo)準(zhǔn)化管理,也是防止T-2毒素污染糧食的有效手段。保證原料免受T-2毒素污染,才能最大程度保證發(fā)酵酒產(chǎn)品該方面的質(zhì)量。

[1] 孫殿軍,劉運(yùn)起,李群偉.黑龍江省大骨節(jié)病區(qū)非病區(qū)主食中T-2毒素檢測報告[J].中國地方病學(xué)雜志,1997,16(4):207-209.

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[6] 曹艷紅,孟憲清,馮杰,等.檢測T-2毒素的直接競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定法的研究[J].中國人獸共患雜志,2006,22(2):132-135.

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Investigation and Analysis of T-2 Toxin in Brewed Wine and Its Risk Assessment

Lai Xintian,Zhang Shiwei,Lan Dixi,Chen Wei,Yang Guowu

(Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection,Shenzhen,Guangdong,518131)

This research establishes the pre-treatment methods of immunological detection of T-2 toxin in beer and wine based on chloroform distillation.The limit of detection is 50ng/mL.The recovery rates were be tween 89.7%-101.3%.This is the first detection of T-2 toxin in beer and wine sold on the market.Based on the research of food structure of Shenzhen people,the risk assessment of T-2 toxin shows a low level in both beer and wine.

T-2 Toxin;Beer;Wine;Risk Assessment

F207.4