高效分離純化藻藍(lán)蛋白新法

廖曉霞，張學(xué)武

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

高效分離純化藻藍(lán)蛋白新法

廖曉霞，張學(xué)武

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

采用殼聚糖親和沉淀－活性炭吸附－DEAE Sephadex A－25柱層析三步法分離純化藻藍(lán)蛋白，與傳統(tǒng)方法相比具有成本低、耗時(shí)短、操作便捷等優(yōu)點(diǎn)。殼聚糖和活性炭結(jié)合使用，可使藻藍(lán)蛋白純度(A620/A280)由0.93提高至2.78。通過(guò)DEAE Sephadex A－25葡聚糖凝膠柱層析后，可得到高純度藻藍(lán)蛋白，純度達(dá)4.3。純化后的藻藍(lán)蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)鑒定，產(chǎn)生分子量分別為16.5ku和17.6ku的α，β亞基條帶。吸收光譜和熒光發(fā)射光譜掃描表明所得蛋白在620、643nm分別具有藻藍(lán)蛋白特征吸收峰和熒光發(fā)射峰。

藻藍(lán)蛋白，殼聚糖，活性炭，純化

藻藍(lán)蛋白(PC)是一種普遍存在于藍(lán)藻和螺旋藻細(xì)胞內(nèi)的捕光色素蛋白，在螺旋藻中的含量高達(dá)7%～20%，在光合作用中能以近乎100%的高效率將光能優(yōu)先傳遞給光系統(tǒng)［1］。藻藍(lán)蛋白不僅在光合作用的原初反應(yīng)機(jī)理的探索方面有重要意義，而且還可以作為熒光分子探針應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究，作為無(wú)毒副作用的天然色素蛋白，可取代合成染料應(yīng)用于食品、化妝品以及醫(yī)藥中。有研究表明，藻藍(lán)蛋白具有抗腫瘤活性，可提高免疫機(jī)能，其特性受到了國(guó)內(nèi)外的重視，并已應(yīng)用于老年癡呆癥和帕金森癥的治療［2－4］。雖然藻藍(lán)蛋白具有十分廣闊的應(yīng)用前景，但由于其分離純化步驟繁瑣，造成藻藍(lán)蛋白商品價(jià)格昂貴，其應(yīng)用受到了一定限制。藻藍(lán)蛋白純化過(guò)程的費(fèi)用約占其成本的50%～90%［4］，因此，解決問(wèn)題的關(guān)鍵在于純化方法的簡(jiǎn)化和高效性。傳統(tǒng)的藻藍(lán)蛋白純化方法包括兩大部分，首先進(jìn)行細(xì)胞裂解以獲取粗提物，常用超聲、反復(fù)凍融、酶解和高壓均質(zhì)等方法。然后將硫酸銨沉淀法與多種色譜層析法(如羥基磷灰石柱、離子交換色譜、分子排阻色潽等)結(jié)合使用，達(dá)到分離純化藻藍(lán)蛋白的目的。傳統(tǒng)方法的主要缺陷在于:a.采用超聲或高壓均質(zhì)等機(jī)械法處理藻粉，能耗高;b.硫酸銨一步或多步沉淀蛋白法常需要1～2d的時(shí)間，而且容易造成蛋白變性，使目標(biāo)蛋白損失率增大;c.傳統(tǒng)方法常需要多步色譜純化步驟，才能獲取高純度藻藍(lán)蛋白，不僅耗時(shí)長(zhǎng)，而且因色譜填料的昂貴造成純化成本的驟增。近年來(lái)，涌現(xiàn)出一些取代傳統(tǒng)方法的新工藝，比如雙水相萃取技術(shù)。但雙水相萃取法所用的聚乙二醇PEG與藻藍(lán)蛋白可穩(wěn)定結(jié)合，目前將藻藍(lán)蛋白與PEG完全分離仍存在一定困難［5］。為了開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、高效的高純度藻藍(lán)蛋白分離方法，文中選取價(jià)格低廉、原料易得的殼聚糖及活性炭處理藻藍(lán)蛋白粗提液，嘗試用一步DEAE－Sephadex A－25柱層析法，制備高純度的藻藍(lán)蛋白。本方法為藻藍(lán)蛋白的純化技術(shù)提供了新思路，有助于促進(jìn)我國(guó)藻藍(lán)蛋白的規(guī)?；_(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺旋藻粉 江門(mén)粵健生物工程有限公司;水溶性殼聚糖 浙江澳興生物科技有限公司;活性炭

廣州清宇活性炭公司;DEAE－Sephadex A－25 美國(guó)Pharmacia公司。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司;自動(dòng)分部收集器 上海滬西儀器廠;冷凍離心機(jī) 美國(guó)PE公司;熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司;30ku超濾管 美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻藍(lán)蛋白粗提液制備 稱(chēng)取1g螺旋藻粉，用去離子水洗滌3～5min，加入15mL 100mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.8)，攪拌浸泡2h，浸提液以8000r/min冷凍離心8min，收集藍(lán)色上清液。

1.2.2 藻藍(lán)蛋白純化 向藻藍(lán)蛋白粗提液中加入一定量2%(w/v)的殼聚糖溶液，調(diào)節(jié)pH至6.9，攪拌5min，離心棄去沉淀，向清液中加入一定量活性炭攪拌5min，離心取上清液。上清液用30ku超濾管超濾濃縮，濃縮液用適量10mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.8，含0.1mol/L氯化鈉)溶解，再用超濾管超濾濃縮至一定體積以備柱層析使用。用10mmol/L磷酸鉀緩沖液(含0.1mol/L氯化鈉)預(yù)平衡DEAESephadex A－25層析柱，上樣，以10mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.8，含0.1～0.3mol/L氯化鈉)梯度洗脫，流速為0.7mL/min，每3min收集1管，測(cè)定每管在280、620nm處的吸收值。

1.2.3 藻藍(lán)蛋白光譜分析 用UV－2450分光光度計(jì)進(jìn)行吸收光譜全波長(zhǎng)掃描，F(xiàn)－4500熒光分光光度計(jì)掃描熒光光譜。

1.2.4 SDS－PAGE電泳 采用垂直板不連續(xù)電泳系統(tǒng)，分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為5%。樣品在濃縮膠中電泳電壓為80V，進(jìn)入分離膠后電壓為120V;剝膠后，以0.1%考馬斯亮藍(lán)R－250染色，用含30%甲醇的10%乙酸脫色。

1.2.5 藻藍(lán)蛋白得率和純度測(cè)定方法 根據(jù)Alka等［4］采用的方法測(cè)定藻藍(lán)蛋白含量:［PC］=(A620－0.7A650)/7.38;藻藍(lán)蛋白得率(Y)計(jì)算方法:Y=［PC］a×Va×100/(［PC］b×Vb);藻藍(lán)蛋白純度以A620/A280表示;式中:［PC］代表藻藍(lán)蛋白的濃度(mg/mL)，A620、A650分別代表藻藍(lán)蛋白溶液在 620、650nm處的吸光度，a、b分別代表所進(jìn)行的純化步驟所得藻藍(lán)蛋白溶液和藻藍(lán)蛋白粗提液，V代表溶液體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖親和沉淀?xiàng)l件的優(yōu)化

殼聚糖由于末端氨基質(zhì)子化，是一種對(duì)pH相當(dāng)敏感的聚合物，在pH小于6.5時(shí)可溶解，但pH大于6.5時(shí)，殼聚糖能與一般帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)產(chǎn)生較強(qiáng)的吸附作用而沉淀［6］，可以通過(guò)調(diào)節(jié)pH使殼聚糖與雜質(zhì)蛋白親和沉淀，進(jìn)而達(dá)到分離純化目的蛋白的最佳效果。溶液的pH及殼聚糖加入量的控制是殼聚糖親和沉淀純化藻藍(lán)蛋白的關(guān)鍵，因此有必要對(duì)親和沉淀?xiàng)l件進(jìn)行摸索和優(yōu)化。由圖1可知，在藻藍(lán)蛋白粗提液中加入0.33%(w/w)殼聚糖時(shí)，調(diào)節(jié)溶液pH至6.9，就可有效純化藻藍(lán)蛋白，純度由0.93提高至1.3，而藻藍(lán)蛋白的得率可達(dá)95%。當(dāng)pH>6.9時(shí)，藻藍(lán)蛋白純度和得率均有下降趨勢(shì)，溶液顏色也由亮藍(lán)色逐漸轉(zhuǎn)為較灰暗的藍(lán)色。殼聚糖與蛋白質(zhì)之間主要是靜電作用，即根據(jù)它們酸堿性、極性的差異，通過(guò)離子間的吸附和脫吸附而將電解質(zhì)各組分分開(kāi)［7］。溶液pH越高，殼聚糖與蛋白質(zhì)之間的吸附作用越強(qiáng)烈，此時(shí)選擇性吸附越差。當(dāng)pH為6.9時(shí)，殼聚糖與一部分雜質(zhì)蛋白吸附沉淀，而與藻藍(lán)蛋白之間的靜電作用較弱，使大部分藻藍(lán)蛋白仍保留在溶液中，從而起到純化的作用。由圖2可知，溶液pH為6.9時(shí)，僅加入0.29%的殼聚糖，就可達(dá)到提高藻藍(lán)蛋白純度的效果，純度可由粗提液的0.93提高至1.52，而藻藍(lán)蛋白的得率仍可維持在90%以上。因此，要根據(jù)所純化的目標(biāo)物來(lái)確定pH和殼聚糖加入量。與傳統(tǒng)的硫酸沉淀法相比，殼聚糖沉淀法耗時(shí)短，只需幾分鐘即可達(dá)到與硫酸銨法［8］相當(dāng)?shù)男Ч耶a(chǎn)品得率高，條件溫和，不易造成蛋白質(zhì)變性。

圖1 pH對(duì)藻藍(lán)蛋白純度和得率的影響注:殼聚糖濃度0.33%(w/w)。

2.2 活性炭吸附條件的優(yōu)化

活性炭(粉炭)有巨大的比表面積，其成本低，使用方法簡(jiǎn)單，且不會(huì)影響提取物的生物活性。目前，國(guó)內(nèi)使用活性炭進(jìn)行脫色、除味等方面的報(bào)道較多，而用活性炭純化藻藍(lán)蛋白的研究未見(jiàn)報(bào)道。由于活性炭具有很強(qiáng)的吸附能力，處理?xiàng)l件的不同，對(duì)純化效果及產(chǎn)品回收率具有較大影響。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用活性炭處理藻藍(lán)蛋白粗提液5min，即可達(dá)到純化藻藍(lán)蛋白的效果，而延長(zhǎng)處理時(shí)間，不但不能使純度進(jìn)一步提高，反而對(duì)藻藍(lán)蛋白的得率影響較大，因此本實(shí)驗(yàn)選擇活性炭處理時(shí)間為5min，并進(jìn)一步確定活性炭加入量對(duì)純化效果的影響。由圖3可知，隨著活性炭加入量的增加，藻藍(lán)蛋白純度可達(dá)到一個(gè)最大值，而蛋白得率則逐漸下降。綜合考慮得率和純度兩個(gè)因素，確定最佳活性炭加入量為80g/L，此時(shí)藻藍(lán)蛋白純度可由1.52提高至2.7，得率為85%。活性炭吸附可以除去色素及部分低分子量蛋白，所得溶液為清亮的藍(lán)色，為進(jìn)一步提高藻藍(lán)蛋白純度奠定基礎(chǔ)。與DEAE－52纖維素柱層析法［9］相比，純化效果相當(dāng)，但該法具有成本低、操作簡(jiǎn)便快捷、產(chǎn)品回收率高等優(yōu)勢(shì)。

圖3 活性炭濃度對(duì)藻藍(lán)蛋白純度和得率的影響

2.3 DEAE－Sephadex A－25柱層析分離

DEAE－Sephadex系列柱料是研究者常采用的純化藻藍(lán)蛋白的填料之一，但一般需要多種色譜串聯(lián)使用，才能獲得高純度藻藍(lán)蛋白［10－11］。采用上述所確定的最佳條件純化藻藍(lán)蛋白，所得藻藍(lán)蛋白純度為2.78。將所得蛋白溶液超濾濃縮至一定體積，上樣后，以磷酸鉀緩沖液洗脫，結(jié)果見(jiàn)圖4。經(jīng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)組分藻藍(lán)蛋白主要集中在第一洗脫峰，第二洗脫峰主要為別藻藍(lán)蛋白，同時(shí)含有少量藻藍(lán)蛋白。合并A620/A280>4.0的洗脫液，超濾管濃縮脫鹽后，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)表明所得藻藍(lán)蛋白純度(A620/A280)為4.3，符合國(guó)際認(rèn)可的高純度藻藍(lán)蛋白要求［12］(A620/A280>4.0)。由此可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)殼聚糖沉淀和活性炭吸附后，一步色譜法即可獲得高純度藻藍(lán)蛋白，減少了色譜填料的費(fèi)用。與純化藻藍(lán)蛋白常用的羥基磷灰石吸附技術(shù)相比，DEAE－Sephadex A－25色譜法具有流速快、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。此外，因藻藍(lán)蛋白在第一洗脫峰即能夠分離出，可以節(jié)省洗脫時(shí)間，提高純化效率。

圖4 藻藍(lán)蛋白經(jīng)DEAE Sephadex A－25凝膠層析洗脫曲線

2.4 藻藍(lán)蛋白光譜特性

由圖5可知，純化后的藻藍(lán)蛋白在620、348、280nm附近有特征吸收峰，在620nm處有藻藍(lán)蛋白的最大特征吸收峰。280nm處的吸收峰為蛋白中芳香族氨基酸的吸收，一般由酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)引起的光吸收，360nm處的較弱吸收峰可能是來(lái)自蛋白中二硫鍵的光吸收。如果藻藍(lán)蛋白變性，其熒光會(huì)減弱或消失，因此把熒光光譜作為鑒定藻藍(lán)蛋白活性的指標(biāo)之一。由圖6可知，在643nm處有藻藍(lán)蛋白特征熒光發(fā)射峰(激發(fā)波長(zhǎng)為590nm)，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道一致［13－14］，可見(jiàn)分離得到了具有活性的藻藍(lán)蛋白。

2.5 SDS－PAGE電泳

將純化各步驟所得的藻藍(lán)蛋白進(jìn)行SDS－PAGE電泳，由圖7可知，經(jīng)殼聚糖和活性炭處理后，雜質(zhì)蛋白逐漸被除去，經(jīng)過(guò)DEAE Sephadex A－25柱層析分離后的藻藍(lán)蛋白可達(dá)到電泳級(jí)別純度，藻藍(lán)蛋白樣品在14ku和20ku之間出現(xiàn)兩條帶，與文獻(xiàn)報(bào)道符合［15］，為α和β亞基，大小分別為16.5ku和17.6ku。

圖5 純化后藻藍(lán)蛋白的紫外－可見(jiàn)吸收光譜圖

圖6 純化后藻藍(lán)蛋白的熒光發(fā)射光譜圖

圖7 SDS－PAGE電泳圖

3 結(jié)論

針對(duì)當(dāng)前藻藍(lán)蛋白純化成本高和商品價(jià)格貴的現(xiàn)狀，開(kāi)發(fā)出一套高效簡(jiǎn)便的藻藍(lán)蛋白純化技術(shù)。本方法主要操作參數(shù)為:藻藍(lán)蛋白粗提液中加入0.29%殼聚糖，調(diào)節(jié)pH至6.9，攪拌5min后，離心棄沉淀，向上清液中加入80g/L活性炭吸附5min，離心，超濾濃縮上清液，采用DEAE Sephadex A－25柱層析法，以10mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.8)+0.1～0.3mol/L氯化鈉梯度洗脫得高純度藻藍(lán)蛋白(純度達(dá)4.3)。與傳統(tǒng)方法相比，殼聚糖親和沉淀－活性炭吸附－DEAE Sephadex A－25柱層析法具有五個(gè)優(yōu)點(diǎn):a.純化步驟少，前處理簡(jiǎn)便;b.能耗小，無(wú)需超聲破碎及高壓均質(zhì);c.成本低，所用活性炭和殼聚糖價(jià)格便宜，一步色譜法減少了填料成本;d.耗時(shí)短，無(wú)需硫酸銨沉淀步驟，整個(gè)過(guò)程只需2d即可完成;e.操作簡(jiǎn)便，具有規(guī)模化應(yīng)用的潛力。

［1］陶冉，位正鵬，崔蓉，等.藻類(lèi)色素蛋白的資源開(kāi)發(fā)和應(yīng)用研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(4):377－379.

［2］AMPARO R，CYNTHIA V，RUPERTO B，et al.Large－scale isolation and purification of C－phycocyanin fromthe cyanobacteria Anabaenamarina using expanded bed adsorption chromatography［J］.J Chem Technol Biotechnol，2010，85:783－792.

［3］CHIU H F，YANG S P，KUO Y L，et al.Mechanisms involved in the antiplatelet effect of C－phycocyanin［J］.Br J Nutr，2006，95:435－440.

［4］ALKA G，JAYASHREE K.Isolation of C－phycocyanin from Synechococcus sp.，(Anacystis nidulans BD1)［J］.J Appl Phycol，2009，10:92－94.

［5］KALYANI M，MUNISHWAR N G，IPSITA R.Affinity－Based Strategies for protein purification［J］.American Chemical Society，2006，34:99－104.

［6］TYAGI R，KUMAR A，SARDAR M，et al.Chitosan as an affinity macroligand for precipitation of N－acetyl glucosamine binding proteins/enzymes［J］.Iso Purif，1996(2):217－226.

［7］夏金蘭，李二平，聶珍媛，等.硅藻土和殼聚糖純化藻藍(lán)蛋白及產(chǎn)品性質(zhì)研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2006，18(6):905－909.

［8］李春霞，吳淑賢，蔡春爾，等.條斑紫菜藻紅、藻藍(lán)蛋白逐級(jí)放大的純化工藝［J］.中國(guó)生物工程雜志，2010，30(1):67－72.

［9］楊芳，郭振江，白燕，等.藻藍(lán)蛋白原位還原Ag(Ⅰ)與納米Ag(0)形成動(dòng)態(tài)過(guò)程的譜學(xué)研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2007，27(1):23－27.

［10］CHEN T F，WONG Y S，ZHENG W J.Purification and characterizationofselenium－containingphycocyanin from selenium－enriched Spirulina platensis［J］.Phytochemistry，2006，67:2424－2430.

［11］REISFL A，MENDES A，LOBO － FERNANDES，et al.Production，Extraction and Purification of Phycobiliproteins from Nostoc sp［J］.Bioresource Technology，1998，66:181－187.

［12］GANAPATHI P，CHETHANA A，SRIDEVI S A，et al.Method to obtain C－phycocyanin of high purity［J］.Journal of Chromatography A，2006，1127:76－81.

［13］NIELS T E.Production of phycocyanin—a pigment with applications in biology，biotechnology，foods and medicine［J］.Appl Microbial Biotechnol，2008，80:1－14.

［14］BOUSSIBA S， RICHMOND A E.Isolation and characterization of phycocyanins from the blue－green alga Spirulina platensis［J］.Arch Microbial，1979，120:155－159.

［15］王廣策，鄧田，曾呈奎.鈍頂螺旋藻C－藻藍(lán)蛋白和異藻藍(lán)蛋白能量傳遞模型的構(gòu)建［J］.科學(xué)通報(bào)，2000，24(2):22－25.

New method for efficient separation and purification of C－phycocyanin

LIAO Xiao－xia，ZHANG Xue－wu
(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

An efficient method was developed for the purification of C－phycocyanin(C－PC)，which involved three steps:chitosan affinity precipitation，activated charcoal absorption and DEAE Sephadex A－25 chromatography.As compared with conventional methods，this method was cheap，time－saving and easy to operate.The purity(A620/A280)of C－phycocyanin obtained after chitosan－activated charcoal treatment was increased from 0.93 to 2.78，which could be improved to 4.3 after being subjected to DEAE Sephadex A－25 chromatography.Analyzed by SDS－PAGE electrophoresis，phycocyanin migrated as two bands corresponding to its two subunits(α and β)and the molecular weights were 16.5ku and 17.6ku，respectively.The absorption spectra and fluorescence emission specra of purified protein showed peaks at 620nm and 643nm，respectively，which was characteristic of C－phycocyanin.

C－phycocyanin;chitosan;activated charcoal;purification

TS254.1

B

1002－0306(2011)06－0273－04

2010－06－03

廖曉霞(1986－)，女，碩士，研究方向:天然活性蛋白質(zhì)研究?；痦?xiàng)目:廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2009B090300271)。