LC FT-ICR MS 精確分析卵清蛋白在真空干燥過(guò)程中的煻期貨修飾

涂宗財(cái)，王 輝，劉成梅，劉光憲，肖 輝

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047;2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究開(kāi)發(fā)中心，江西南昌330200;3.美國(guó)葉史瓦大學(xué)愛(ài)因斯坦醫(yī)學(xué)院，美國(guó)紐約10461)

LC FT-ICR MS 精確分析卵清蛋白在真空干燥過(guò)程中的煻期貨修飾

涂宗財(cái)1，王 輝1，劉成梅1，劉光憲2，肖 輝3

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047;2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究開(kāi)發(fā)中心，江西南昌330200;3.美國(guó)葉史瓦大學(xué)愛(ài)因斯坦醫(yī)學(xué)院，美國(guó)紐約10461)

研究了卵清蛋白與葡萄糖混合物在真空干燥的過(guò)程中，卵清蛋白的糖基化修飾情況。首次采用胃蛋白酶和液相－傅立葉變換離子回旋共振(LC－FT－ICR)精確質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)卵清蛋白的糖基化修飾位點(diǎn)進(jìn)行研究，其蛋白質(zhì)覆蓋率可以達(dá)到100%，研究發(fā)現(xiàn)在真空干燥過(guò)程中，卵清蛋白中的賴氨酸會(huì)與還原糖發(fā)生美拉德初級(jí)反應(yīng)，形成糖基化修飾，主要發(fā)生在卵清蛋白的K47，56，62，182，190，323和370的賴氨酸氨基上，而卵清蛋白中的精氨酸和氮末端氨基未發(fā)現(xiàn)被糖基化修飾;同時(shí)，采用離子碰撞誘導(dǎo)解離三級(jí)質(zhì)譜CID－MS3驗(yàn)證m/z7863+的離子峰為m/z7323+的離子峰上添加一個(gè)162Da。本論文的研究為精確分析蛋白質(zhì)修飾的一級(jí)結(jié)構(gòu)變化提供了重要的研究方法，為真空干燥在實(shí)驗(yàn)分析中的應(yīng)用提供重要參考。

真空干燥，糖基化，卵清蛋白，液相－傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(LC FT－ICR MS);胃蛋白酶

美拉德反應(yīng)是食品加工、貯藏中普遍存在的且重要的化學(xué)反應(yīng)，該反應(yīng)的初級(jí)階段是蛋白質(zhì)中的賴氨酸或精氨酸的ε－氨基和氮末端氨基與還原糖之間形成Schiff產(chǎn)物，然后發(fā)生重排生成Amadori或者Heyns產(chǎn)物［1］。美拉德反應(yīng)的初級(jí)階段是氨基與還原糖反應(yīng)［2］，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的糖基化修飾。目前研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)在加熱、貯藏及人體生理活動(dòng)過(guò)程中均會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，在營(yíng)養(yǎng)方面會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的必需氨基酸損失［3－4］，在病理研究方面是某些疾病的重要表征，同時(shí)也有研究表明美拉德產(chǎn)物具有很好的抗氧化活性和抗過(guò)敏性［5］。由此可見(jiàn)，在相關(guān)分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，樣品前處理對(duì)蛋白質(zhì)美拉德反應(yīng)的影響非常重要。目前在生物、食品及分析檢測(cè)領(lǐng)域，真空干燥以其快速、簡(jiǎn)便、溫和等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。但是，樣品在真空干燥過(guò)程中，蛋白質(zhì)是否會(huì)和還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的重要氨基酸被糖基化修飾，而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，目前，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。因此，本工作擬采用測(cè)序級(jí)胃蛋白酶和 LC FT－ICR精確質(zhì)譜技術(shù)分析卵清蛋白(Ovalbumin，Oval.)和葡萄糖混合物在真空干燥過(guò)程中的糖基化修飾情況，并采用CID－MS3對(duì)糖基化修飾離子峰進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 天然Oval.的胃蛋白酶酶解肽中含有賴氨酸的肽段分布

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卵清蛋白Ⅳ、D－葡萄糖、胃蛋白酶 Sigma公司;其他化學(xué)試劑 sigma，分析純?cè)噭?/p>

FT－ICR MS 美國(guó)Varian公司;LTQ－ESI CID MS 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;配兩個(gè)LC－10AD泵的液相 日本島津公司;1.0mm×50mm C3柱子 美國(guó)Micro－Tech Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 卵清蛋白與葡萄糖混合物的真空干燥處理

采用pH7.8Tris HCl溶液配制20mg/mL卵清蛋白、10mg/mL葡萄糖混合溶液 100μL，在真空度為－0.1MPa，20℃條件下，旋轉(zhuǎn)真空干燥8h，得到卵清蛋白與葡萄糖固體混合物樣品(水分含量2.34% ±0.2%)。

移取200μL的超純水添加于干燥后的樣品管中，使固體樣品完全溶解，采用5000分子量濾膜除去多余葡萄糖，純化后卵清蛋白定容至200μL，備用。1.2.2 巰基還原及乙?；幚?添加 10μL 200mmol/L DTT溶液于樣品中，混勻，室溫條件下放置1h;添加50μL 200mmol/L碘乙酰胺溶液于樣品溶液中，混勻，室溫條件下放置1h;添加50μL 200mmol/L DTT溶液于樣品溶液中，混勻，室溫條件下放置1h。而后添加690μL超純水至樣品溶液中，備用。

1.2.3 胃蛋白酶酶解 移取0.5μL還原乙?；蟮穆亚宓鞍讟悠啡芤河?0μL pH2.2的鹽酸溶液中，添加5μL 1%的胃蛋白酶溶液，在0℃條件下酶解10min，移取20μL酶解液上樣。

1.2.4 LC FT－ICR MS檢測(cè)分析［6］采用雙泵微米級(jí)液相進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相A:5%乙腈，0.1%甲酸水溶液;流動(dòng)相 B:95%乙腈溶液。洗脫梯度為:0～5min，98%A，2%B;6min，85%A，15%B;15min，70%A，30%B;16min，50%A，50%B;17～22min，5%A，95%B;23min，95%A，5%B;28min，STOP。流速為0.05mL/min，進(jìn)樣量為20μL，液相設(shè)備與FT－ICR直接連接，在6min時(shí)采集圖譜，采集時(shí)間為15min。

1.2.5 LTQ－CID MS3檢測(cè)分析 分別收集步驟1.2.4中LC的洗脫液，采用LTQ－CID MS3進(jìn)行檢測(cè)。借助哥倫比亞大學(xué)的蛋白質(zhì)分析工具網(wǎng)站進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 天然Oval.的胃蛋白酶酶解肽圖譜

對(duì)蛋白質(zhì)的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行定位的研究一般采用測(cè)序級(jí)胰蛋白酶［7－8］、Asp N［9］等特異性強(qiáng)的蛋白質(zhì)酶進(jìn)行酶解，但是由于胰蛋白酶的特異性位點(diǎn)為賴氨酸和精氨酸，而蛋白質(zhì)的糖基化位點(diǎn)一般為賴氨酸和精氨酸，因此胰蛋白酶在進(jìn)行蛋白質(zhì)的糖基化位點(diǎn)定位研究時(shí)存在一定困難，而Asp N的酶活相對(duì)較差，檢測(cè)比較困難，蛋白質(zhì)的覆蓋率較低。因此，本論文首次采用特異性較差的胃蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行短時(shí)間酶解，對(duì)酶解肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。

FT－ICR MS為高精確質(zhì)譜技術(shù)，其精確度可以達(dá)到1ppm，本論文采用該質(zhì)譜技術(shù)對(duì)胃蛋白酶酶解肽進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)軟件分析和哥倫比亞大學(xué)的蛋白質(zhì)分析工具網(wǎng)站精確確定酶解液中的主要肽段，蛋白質(zhì)覆蓋率可以達(dá)到100%。

表1為測(cè)序級(jí)胃蛋白酶酶解卵清蛋白后的肽段分布，其中離子峰為m/z750，m/z732+3，m/z888+2的肽段有少量被糖基化，即發(fā)現(xiàn)糖基化肽段的離子峰(+162Da)，因此，天然Oval.中的K17和K93被糖基化修飾。由于m/z732+3的蛋白質(zhì)片段中含有兩個(gè)K，結(jié)合m/z783+2中僅含有K47且未出現(xiàn)糖基化修飾的離子峰，因此，可以斷定K56被糖基化修飾。

表2 卵清蛋白酶解肽段中新的糖基化離子峰

蛋白質(zhì)中的R和氮末端氨基也會(huì)與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，但是，通過(guò)對(duì)相關(guān)肽段的分析，未發(fā)現(xiàn)天然Oval.中的R和氮末端氨基發(fā)生糖基化修飾的離子峰。

2.2 LC FT－ICR對(duì)真空干燥后Oval.進(jìn)行測(cè)量

蛋白質(zhì)與還原糖一般在加熱、長(zhǎng)期貯藏或人體生理活動(dòng)中容易發(fā)生Maillard反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)中賴氨酸、精氨酸的破壞和營(yíng)養(yǎng)損失。因此，真空干燥過(guò)程中，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氨基酸損失或糖基化修飾，從而影響實(shí)驗(yàn)分析的結(jié)果。本論文針對(duì)真空干燥對(duì)卵清蛋白的糖基化修飾情況進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)，真空干燥過(guò)程中，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生一定的糖基化修飾作用。

由表2中可看出，離子峰為589+2、595+2、971+2、653+2、665+2的肽段均出現(xiàn)了+162Da的新峰，分別為670+2、676+2、1052+2、734+2、746+2，而 m/z732+3的肽段+162Da為m/z786+3，在天然Oval.中即存在，但是，經(jīng)過(guò)真空干燥處理后，出現(xiàn)新的離子峰m/z840+3，糖基化肽的離子峰強(qiáng)度明顯比天然蛋白質(zhì)的離子峰高，如圖1。

圖1 天然Oval.(A)和處理后Oval.(B)酶解肽段

由于 R和氮末端氨基也可以與還原糖發(fā)生Maillard反應(yīng)［10］，因此，本研究比較分析了真空干燥前后的Oval.胃酶解肽中含有R的肽段和含有氮末端的肽段m/z824，未發(fā)現(xiàn)有糖基化修飾的新的離子峰出現(xiàn)，因此，可以斷定，在真空干燥過(guò)程中，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)賴氨酸的損失。

2.3 CID MS3對(duì)母離子峰進(jìn)行質(zhì)譜分析

通過(guò)計(jì)算可以得出，增加162Da的新的離子峰即為發(fā)生糖基化修飾。為了對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證，本論文采用CID MS3進(jìn)行分析。如圖1，以m/z7323+為例，糖基化后的新的離子峰為7863+，由于糖基化肽段進(jìn)行MS2分析時(shí)，糖基被打散，無(wú)法準(zhǔn)確分析肽段的氨基酸序列，因此，對(duì)m/z786+3的裂解峰m/z7323+進(jìn)行CID MS分析，如圖2。

m/z786+3的裂解峰 732+3的 CID MS圖譜與m/z732+3［VYLGAKDSTRTQINKVVRF］的裂解質(zhì)譜圖正好吻合，如等主要峰均相符。因此，可以準(zhǔn)確判定，m/z786+3是肽段VYLGAKDSTRTQINKVVRF(m/z732+3)的糖基化修飾離子峰。

圖2 m/z7863+裂解峰m/z7323+的CID MS質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

綜上分析，在真空干燥過(guò)程中，卵清蛋白中的賴氨酸會(huì)與還原糖發(fā)生美拉德初級(jí)反應(yīng)，賴氨酸上發(fā)生糖基化修飾，而卵清蛋白中的R和氮末端氨基不會(huì)與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)。本論文采用胃蛋白酶酶解和LC FT－ICR精確質(zhì)譜技術(shù)可以準(zhǔn)確分析蛋白質(zhì)的糖基化修飾情況，其蛋白質(zhì)覆蓋率可以達(dá)到100%，與胰蛋白酶、AspN等測(cè)序級(jí)蛋白酶相比，胃蛋白酶的酶解時(shí)間較短，可以在0℃條件下進(jìn)行，從而大大降低酶解時(shí)間對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響。因此，本論文的研究為精確分析蛋白質(zhì)修飾的一級(jí)結(jié)構(gòu)變化提供了重要的研究方法，為真空干燥在實(shí)驗(yàn)分析中的應(yīng)用提供了重要參考。

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Study on the glycation of ovalbumin during vacuum drying with D－glucose using LC FT－ICR MS

TU Zong－cai1，WANG Hui1，LIU Cheng－mei1，LIU Guang－xian2，XIAO Hui3
(1.State Key Lab of Food Science and Technology of Nanchang University，Nanchang 330047，China;2.Food Research Centre，Jiangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanchang 330200，China;3.Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University，New York 10461，USA)

The glycation of ovalbumin during vacuum drying with D－Glucose was studied using LC FT－ICR mass spectrometry.The protein coverage was as high as 100%with pepsin digestion followed by LC FT－ICR MS analysis.A number of Lysines of ovalbumin including K47，56，62，182，190，323 and 370 were glycated with the reduced sugar by Maillard Reaction during vacuum drying.However，the Arginine and amido of N－terminal were not glycated by the reduced sugar.At the same time，CID－MS/MS/MS was used to determine if m/z 7863+was the new peak resulting from glycation，i.e.m/z7323+plus 162Da.This paper provided a new method to study protein modifications in the amino acid sequence，offered an important reference for the vacuum drying applications.

vacuum drying;glycation;ovalbumin;LC FT－ICR MS;pepsin

TS201.2

A

1002－0306(2011)06－0090－04

2011－03－22

涂宗財(cái)(1965－)，男，博士，教授，研究方向:食品生物大分子的改性。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20976078);國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索項(xiàng)目(SKLF－TS－200923)。