微波預(yù)處理－溶劑回流提取白芷香豆素類成分的工藝研究

張小維，董自亮，肖丹

點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 610075

白芷為一種常用中藥，中國藥典2005年版收載的白芷為傘形科植物白芷 Angelica dahurica(Fisch．ex Hoffm．)Benth．et Hook．f或杭白芷 Angelica dahurica(Fisch．ex Hoffm．)Benth．et Hook．f．var．formosana(Boiss．)shan et Yuan的干燥根，具有散風(fēng)除濕、通竅止痛、消腫排膿的作用，臨床廣泛應(yīng)用于感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻淵、牙痛、白帶和瘡瘍腫痛等癥，并有較好的療效［1］。白芷中香豆素類為其鎮(zhèn)痛的主要成分，又以歐前胡素、異歐前胡素和氧化前胡素為其主要成分，其止痛效果已被充分肯定［2］。白芷中香豆素含量的高低，是中藥白芷品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。

微波預(yù)處理過程中微波作用的是剛好被汽化劑濕潤的物料，微波幾乎全被物料吸收，處理時(shí)間只有幾十秒，由于處理時(shí)間短，微波對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的破壞輕，提取效果好［3－5］。本文采用微波預(yù)處理的方法［6］，該法在半干狀態(tài)下，先用微波輻射破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，然后采用傳統(tǒng)法進(jìn)行提取，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法對(duì)微波預(yù)處理提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得出了最佳參數(shù)組合。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(島津LC－2010 AHT，島津Class vp色譜工作站);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R－205，上海申勝生物技術(shù)有限公司);電子天平(BP－211D，Sartorius，德國);超聲波清洗器(KQ－300E，昆山市超聲儀器有限公司);微波爐(MM721AAU－PW，佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司);循環(huán)水式真空泵(SHB－3，鄭州杜甫儀器廠);微型植物粉碎機(jī)(FZ102，天津市泰斯特儀器有限公司)，等。

1.2 材料

白芷藥材于2009年11月采自四川省遂寧市，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)馬逾英教授鑒定為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch．ex Hoffm．)Benth．et Hook．f的干燥根，符合中國藥典2005年版一部白芷項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定，陰干，粉碎成不同大小的粉末，備用。所用甲醇、乙醇等化學(xué)試劑均為分析純，水為雙蒸水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取方法

2.1.1 傳統(tǒng)提取

取白芷粉末10 g，加入75%乙醇60 mL，回流提取2次，每次提取60 min，過濾，合并濾液，待用。

2.1.2 微波預(yù)處理提取

2.1.2.1 稱取10 g白芷藥材粗粉于表面皿中，滴加一定量汽化劑(一定濃度的乙醇溶液)使之濕潤均勻，然后鋪平，厚度在3～5 mm左右，靜置一段時(shí)間，使溶液充分滲入細(xì)胞組織內(nèi)。

2.1.2.2 將濕潤好的白芷粉末放入微波爐中進(jìn)行快速加熱預(yù)處理，使?jié)B入細(xì)胞組織內(nèi)的乙醇溶液快速汽化。

2.1.2.3 將上述處理過的白芷粉末，加60 mL乙醇后，回流提取60 min，趁熱過濾，提取2次，合并濾液至200 mL量瓶中。藥渣用乙醇洗滌2～3次，并入濾液，放冷，定容，搖勻，備用。

2.2 白芷中歐前胡素含量測定及方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件

色譜柱為 Dikma C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);檢測波長:300 nm;流動(dòng)相:甲醇－水(70∶30);流速:1 mL·min－1;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;理論塔板數(shù)按歐前胡素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000(圖1)。

圖1 歐前胡素對(duì)照品(A)與白芷提取液(B)的HPLC圖

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取歐前胡素對(duì)照品4.82 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密量取白芷提取液1 mL，加甲醇定容至10 mL，搖勻，進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取 10 μL 不同濃度(4.82、9.64、19.28、28.92、38.56、48.20 μg·mL－1)的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件測定，以峰面積與質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，得線性方程為Y=6054.7457X+5028.1397，(r=0.999 9，n=6)。結(jié)果表明，歐前胡素對(duì)照品溶液在4.82 μg·mL－1～ 48.20 μg·mL－1的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測定，結(jié)果歐前胡素峰面積的RSD為1.70%。

2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一對(duì)照品溶液，分別在 0、2、4、6、8 h測定，按上述色譜條件測定，得出RSD為1.62%，表明被測物在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

同一批號(hào)白芷藥材按照“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備5份，測定RSD為1.91%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別精密稱取同一白芷藥材粉末約0.2 g(約含有歐前胡素0.42 mg)9份，分成高、中、低3組，精密加入相當(dāng)于樣品中含量50%、100%、150%的歐前胡素對(duì)照品，按照“2.2.3”項(xiàng)下平行制備供試品溶液，計(jì)算得平均回收率為100.74%，RSD為1.29%(表1)。

表1 加樣回收試驗(yàn)測定結(jié)果

2.2.9 樣品含量測定

取白芷提取液樣品，平行制備3份供試品，分別吸取10 μL進(jìn)行測定，計(jì)算得提取液中歐前胡素的含量為0.21%(n=3)。

3 結(jié)果與分析

3.1 微波預(yù)處理汽化劑濃度的影響

稱取白芷粉末5份，分別加入2.5 mL· g－1不同濃度(40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇，微波輻射150 s，75%乙醇60 mL回流提取2次，每次40 min，提取結(jié)果見圖2。

圖2 汽化劑濃度對(duì)歐前胡素提取率的影響

實(shí)驗(yàn)中采用乙醇溶液作為預(yù)處理汽化劑，從圖2可知，乙醇濃度不同，提取率也不同，這與乙醇溶液滲透白芷藥材細(xì)胞膜效果不同相關(guān)，滲透細(xì)胞膜效果越好，微波對(duì)細(xì)胞壁的破壞效果越好，提取率也越高。圖2表明乙醇濃度為60%時(shí)，歐前胡素含量達(dá)最大值，說明此時(shí)乙醇溶液滲透白芷細(xì)胞膜效果最好。

3.2 微波汽化劑用量的影響

稱取白芷粉末 5 份，分別加入 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0倍量的60%乙醇，微波輻射150 s，75%乙醇60 mL回流提取2次，每次40 min，提取結(jié)果見圖3。

圖3 汽化劑用量對(duì)歐前胡素提取率的影響

從圖3中可看到，隨汽化劑用量增加，提取率也增加，到達(dá)最大值后，提取率隨汽化劑用量增加反而減少?？赡茉蚴?當(dāng)微波汽化劑用量少時(shí)，汽化不充分，同時(shí)在一定微波輻射量下汽化劑被蒸干，易導(dǎo)致物料溫度過高，細(xì)胞被破壞過度，造成部分有效成分損失，影響提取得率;而當(dāng)汽化劑用量過大時(shí)，在一定微波輻射量下，多余的汽化劑蒸發(fā)，消耗了微波能，使?jié)B透到細(xì)胞內(nèi)的汽化劑汽化不充分，造成物料溫度低，細(xì)胞壁破壞不夠，提取率不高。圖3表明，汽化劑用量為2.5倍量，即2.5 mL· g－1時(shí)，提取效果最佳。

3.3 微波預(yù)處理時(shí)間的影響

以60%乙醇2.5 mL· g－1為汽化劑，分別微波預(yù)處理60、90、120、150、180 s，然后用75%乙醇60 mL 回流提取2次，每次40 min。提取結(jié)果見圖4。

圖4 微波輻射時(shí)間對(duì)歐前胡素提取率的影響

從圖4可知，隨輻射時(shí)間延長，提取率逐漸提高，至150 s時(shí)達(dá)最大后，提取率迅速下降，存在一個(gè)最佳的微波輻射時(shí)間。這是由于隨著輻射時(shí)間增加，物料逐步變干，溫度不斷上升，細(xì)胞被破壞程度逐漸增加，提取率也不斷提高;但微波破壞細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)破壞有效成分，輻射時(shí)間越長，有效成分損失越多，而且細(xì)胞粉碎過細(xì)也會(huì)造成內(nèi)傳質(zhì)阻力增大，引起提取率下降。在輻射功率一定的條件下，控制微波輻射時(shí)間是為了控制加熱程度，以獲得最大提取率。圖4表明，本實(shí)驗(yàn)微波輻射的最佳時(shí)間為150 s。

3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化微波預(yù)處理工藝參數(shù)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取汽化劑用量(A)、汽化劑濃度(B)和微波輻射時(shí)間(C)，三個(gè)因素分別取三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，見表2;以白芷歐前胡素的含量為考核指標(biāo)，用L9(34)正交表安排試驗(yàn)，結(jié)果及方差分析見表3、表4。

表2 微波預(yù)處理影響因素水平表

表3 正交試驗(yàn)及結(jié)果

表4 方差分析表

由極差及方差分析結(jié)果可知，影響因素的大小順序C＞A＞B，微波預(yù)處理最優(yōu)工藝為 C3A3B2，即:微波汽化劑為60%乙醇，用量為物料的2.5倍(mL·g－1)，微波輻射 150 s。

3.6 后續(xù)提取時(shí)間的影響

以2.5 mL· g－1的60%乙醇為汽化劑，微波輻射150 s，用75%乙醇60 mL回流提取2次，每次分別提取20、30、40、50、60 min 時(shí)所得歐前胡素的含量(圖5)。

與傳統(tǒng)的醇提相似，歐前胡素含量隨提取時(shí)間的增加而上升，但提取40 min以后含量增加不明顯，考慮到實(shí)際生產(chǎn)情況，確定后續(xù)提取時(shí)間為40 min。

圖5 后續(xù)提取時(shí)間對(duì)歐前胡素提取率的影響

3.7 后續(xù)提取溶劑濃度的影響

以60%乙醇為汽化劑，用量2.5 mL·g－1，微波輻射150 s，分別以55%、65%、75%、85%、95%乙醇60 mL回流提取2次，每次提取40 min，結(jié)果見圖6。

圖6 后續(xù)提取溶劑的濃度對(duì)歐前胡素提取率的影響

從圖6可知，當(dāng)后續(xù)提取乙醇濃度為75%時(shí)，白芷歐前胡素的提取效果最佳。

3.8 微波預(yù)處理法與傳統(tǒng)提取比較

按最優(yōu)微波預(yù)處理?xiàng)l件和確定的后續(xù)提取條件，進(jìn)行白芷歐前胡素提取，結(jié)果含量為0.211%，在正交試驗(yàn)結(jié)果中較高，表明篩選出來的最適條件可信。微波預(yù)處理法與傳統(tǒng)提取法進(jìn)行比較，結(jié)果見表5。微波預(yù)處理提取法所用時(shí)間只有傳統(tǒng)提取法的一半，歐前胡素的提取率提高1.11%左右;說明經(jīng)過微波預(yù)處理后，后續(xù)提取時(shí)間縮短，提取速度大大加快，方法具有可行性。

表5 微波預(yù)處理提取法與傳統(tǒng)提取法比較

4 結(jié)論

4.1 本課題組通過白芷提取工藝的正交試驗(yàn)研究以及對(duì)汽化劑乙醇濃度、用量和微波處理時(shí)間的深入探討，確定了微波預(yù)處理提取白芷中歐前胡素的最佳工藝參數(shù)為:以60%乙醇為汽化劑，用量為2.5 mL· g－1，輻射時(shí)間150 s，75%乙醇常規(guī)回流提取2次，每次40 min;運(yùn)用該法所得歐前胡素含量可達(dá)到0.211%。

4.2 本研究是在半干狀態(tài)下，先用微波輻射破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)行傳統(tǒng)法提取。由于微波作用的是剛好被汽化劑濕潤的物料，微波幾乎全被物料吸收，處理時(shí)間短，微波對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的破壞小，提取效果好，為后續(xù)的工藝帶來了方便，有著廣闊的發(fā)展前景。

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