STP磷酸化處理對小麥面筋蛋白酶解特性的影響

朱永勝,王金水,渠琛玲,蘇彩娟

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450052)

STP磷酸化處理對小麥面筋蛋白酶解特性的影響

朱永勝,王金水＊,渠琛玲,蘇彩娟

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450052)

以復(fù)合蛋白酶為水解酶,研究了小麥面筋蛋白酶解前 STP磷酸化處理對其酶解特性的影響.通過單因素試驗和正交試驗確定磷酸化處理的最佳工藝條件為:STP添加量為小麥面筋蛋白的 9%,溫度 25℃,pH8.5,處理時間 30 min.同時研究了 STP磷酸化處理后小麥面筋蛋白在酶解過程中的水解度和蛋白提取率的變化規(guī)律.

磷酸化處理;小麥面筋蛋白;酶解特性;水解度

0 引言

小麥面筋蛋白,又名活性面筋或谷朊粉,是小麥淀粉生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物,主要由醇溶蛋白和麥谷蛋白組成.由于小麥面筋蛋白中含有大量的疏水性氨基酸且分子內(nèi)的疏水作用區(qū)域較大,導(dǎo)致其溶解性較低并限制了小麥面筋蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用[1].國內(nèi)外學(xué)者通過對小麥面筋蛋白進(jìn)行改性以拓寬其應(yīng)用范圍,其中酶法改性僅使肽鍵斷裂而氨基酸的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型保持不變,不會產(chǎn)生有毒、有害物質(zhì).因此隨著人們對食品安全的日益關(guān)注,酶法改性將成為食品工業(yè)發(fā)展的必然趨勢.但由于小麥面筋蛋白獨特的結(jié)構(gòu)和組成,酶解時蛋白酶不易靠近酶切位點,導(dǎo)致其酶解速度緩慢,水解不徹底,酶解產(chǎn)物復(fù)雜多變.因此,酶解前對小麥面筋蛋白做適當(dāng)處理,使蛋白質(zhì)變性或改變其組成及結(jié)構(gòu),有利于酶解的進(jìn)行[2].

三聚磷酸鈉 (STP)是我國 GB2760-1996和FDA允許使用的食品添加劑,STP對蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化修飾可同時改善蛋白質(zhì)的功能和營養(yǎng)性質(zhì)[3].Ferrel等[4]認(rèn)為在弱堿性 (pH7～9)環(huán)境中蛋白質(zhì)分子中的自由氨基 (如賴氨酸ε-NH2)活性較大,因此可以接入一個磷酸根基團(tuán)使其變成賴氨酸磷酸酯.磷酸根基團(tuán)的引進(jìn)增加了蛋白質(zhì)的電負(fù)性,可提高蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力,改善蛋白質(zhì)的溶解性.

因此,為了改善小麥面筋蛋白酶解特性,提高其蛋白質(zhì)利用率,作者用 STP對小麥面筋蛋白酶解前進(jìn)行磷酸化處理,研究了磷酸化處理對小麥面筋蛋白酶解特性的影響.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥面筋蛋白 (蛋白質(zhì)含量 69.4%):市售;復(fù)合蛋白酶 (1.5×105U/g):丹麥諾維信;三聚磷酸鈉 (STP):天津市瑞金特化學(xué)品有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

PHS—3C型 pH計:上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠;HJ—4型多頭磁力攪拌器:江蘇正基儀器有限公司;HH—2型數(shù)顯恒溫水浴鍋:金壇市杰瑞爾電器有限公司;BS210S型電子天平:北京賽多利斯有限公司 ;LD5—2A型離心機:北京醫(yī)用離心機廠;KDN—08C定氮儀:上海新嘉電子有限公司.

1.3 方法

1.3.1 磷酸化處理和酶水解方法

稱取一定量的小麥面筋蛋白,加蒸餾水制成懸浮液后用磁力攪拌器攪拌,在攪拌過程中加入三聚磷酸鈉 (STP),用 1 mol/L的NaOH調(diào)至最適pH,反應(yīng)過程中維持溫度和 pH恒定,反應(yīng)完成后冷卻,調(diào) pH至 7.0.調(diào)節(jié)至酶的最適條件下進(jìn)行酶解,測定水解度和蛋白提取率.

1.3.2 磷酸化程度測定方法[5]

磷酸化反應(yīng)結(jié)束后取 5 mL反應(yīng)溶液,加入過量的 10%三氯乙酸使蛋白質(zhì)沉淀,4 000 r/min條件下離心 5 min,取上清液加入過量醋酸鋅并調(diào)pH值在 3.8～3.9之間,使上清液中的焦磷酸以Zn2P2O2形式沉淀,然后用 pH10的氨緩沖液溶解Zn2P2O2,絡(luò)黑 T作為指示劑,EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定 Zn2+,用消耗的 EDTA體積表示磷酸化程度.

1.3.3 游離氨基氮的測定

甲醛滴定法[6].

1.3.4 水解度測定

1.3.5 蛋白提取率的測定

蛋白提取率是用來檢測在酶解反應(yīng)過程中,反應(yīng)產(chǎn)物對原料蛋白的利用率.

將酶解液在 6 000 r/min條件下離心 20 min,取上清液,用凱氏定氮法測定其蛋白含量,即為水溶性蛋白質(zhì)含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合蛋白酶酶解小麥面筋蛋白的最佳條件

根據(jù)廠家推薦參數(shù)和課題組前期試驗成果,以水解度為指標(biāo),通過正交試驗得到復(fù)合蛋白酶酶解小麥面筋蛋白的最優(yōu)條件為:蛋白質(zhì)濃度為5%,溫度 50℃,pH值為 7.0,蛋白酶用量 [E/S]=3 500 U/g.

2.2 磷酸化處理時各因素對小麥面筋蛋白酶解特性的影響

考察了磷酸化處理過程中 STP添加量、反應(yīng)時間、溫度和 pH等因素對磷酸化程度的影響,以2.1中的最佳酶解條件對處理后的小麥面筋蛋白進(jìn)行酶解,進(jìn)而考察磷酸化處理時各因素對小麥面筋蛋白酶解特性的影響.

2.2.1 磷酸化處理 STP添加量對小麥面筋蛋白酶解特性的影響

在 STP添加量分別為 0、3%、6%、9%、12%的條件下,小麥面筋蛋白的磷酸化程度及其水解度的變化見圖 1.

圖1 磷酸化處理 STP添加量對小麥筋蛋白水解度的影響

由圖 1可以看出,當(dāng) STP添加量為小麥面筋蛋白的 9%以下時,小麥面筋蛋白的水解度隨著STP添加量的增加而逐漸升高;當(dāng)添加 STP的量超過小麥面筋蛋白的 9%時,隨著 STP添加量的增加雖然磷酸化程度繼續(xù)增加,但小麥面筋蛋白的水解度呈下降趨勢.其原因可能是蛋白質(zhì)磷酸化改性的實質(zhì)是其氨基酸殘基磷酸酯化反應(yīng),隨著磷酸化程度的增加,蛋白質(zhì)的電負(fù)性也增加,從而提高了小麥面筋蛋白的溶解性,增加了有效水解位點,水解度增加.但如果 STP添加過多,過高的離子強度會增大蛋白質(zhì)的疏水性,引起蛋白質(zhì)及其亞基的變性凝聚,最終蛋白水解度呈下降趨勢.因此,確定 STP添加量為 9%.

2.2.2 磷酸化處理時間對小麥面筋蛋白酶解特性的影響

在水解時間為 10、30、50、70、90 min的條件下,小麥面筋蛋白的磷酸化程度及其水解度的變化見圖 2.

圖2 磷酸化處理時間對小麥面筋蛋白水解度的影響

由圖 2可知,在前 30 min內(nèi)磷酸化反應(yīng)迅速進(jìn)行并基本完成,繼續(xù)增加反應(yīng)時間,磷酸化程度趨于平衡.磷酸化處理后的小麥面筋蛋白酶解時的水解度趨勢也是如此,其水解度隨著磷酸化程度的增加而提高,在處理 30 min時水解度達(dá)到最高值,此后增加處理時間水解度再無明顯提高.因此,確定磷酸化處理時間為 30 min.

2.2.3 磷酸化處理 pH對小麥面筋蛋白酶解特性的影響

在處理 pH為 6、7、8、9、10的條件下 ,小麥面筋蛋白的磷酸化程度及其水解度的變化見圖 3.由圖3可知,由于蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基在弱堿性環(huán)境中活性較大,反應(yīng)比較容易進(jìn)行,在 pH7～9之間時磷酸化程度最高,此時小麥面筋蛋白酶解時的水解度也最大.如果 pH過高,蛋白會被堿改性而變性,反而不利于磷酸化處理的進(jìn)行,所以水解度也降低.因此,確定磷酸化處理時 pH值為 8.

圖3 磷酸化處理 pH對小麥面筋蛋白水解度的影響

2.2.4 磷酸化處理溫度對小麥面筋蛋白酶解特性的影響

圖4 磷酸化處理溫度對小麥面筋蛋白水解度的影響

在磷酸化處理溫度為 20、25、30、35、40、45 ℃的條件下,小麥面筋蛋白的磷酸化程度及其水解度的變化見圖 4.由圖 4可知,磷酸化程度隨溫度的上升而快速增加,在 30℃時達(dá)到最大,此后隨著溫度的升高磷酸化程度反而下降.說明溫度太高不利于磷酸化的進(jìn)行,這與李瑜等[7]的研究結(jié)論一樣.同時小麥面筋蛋白酶解時的水解度也是在磷酸化處理溫度為 30℃時最大,故得出磷酸化處理的溫度為 30℃.

2.3 正交試驗

為了得到最佳的處理效果,根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定因素和水平,以水解度為指標(biāo),采用L9(34)正交表對磷酸化處理的條件進(jìn)行正交優(yōu)化試驗,因素與水平見表1,試驗結(jié)果見表2,方差分析見表3.

表1 正交試驗因素與水平

表2 正交試驗結(jié)果

由表2可知,影響因素的主次順序為:C、D、A、B(主→次),即磷酸化處理溫度對小麥面筋蛋白水解度影響最大,其次是 STP添加量和反應(yīng)時間,磷酸化處理時 pH值對結(jié)果影響最小.最佳組合為 A2B2C1D2,即 STP添加量為小麥面筋蛋白的 9%,溫度為 25℃,pH為 8.5,處理時間為30 min.

表3 正交試驗方差分析

由表3可知,因素 C(磷酸化處理溫度)和因素D(STP添加量)對試驗結(jié)果影響顯著 (P＜0.10),而因素 A(磷酸化處理時間)和 B(磷酸化處理 pH)對試驗結(jié)果影響不顯著.綜合考慮極差分析和方差分析的結(jié)果,確定小麥面筋蛋白酶解前磷酸化處理的最佳條件為:A2B2C1D2,即 STP添加量為小麥面筋蛋白的 9%,溫度為25℃,pH為 8.5,處理時間為 30 min.

由于正交表中不存在此種搭配方案,所以按照此搭配做試驗驗證,分別做 3組平行,并測定其蛋白提取率,結(jié)果如表4所示,平均水解度達(dá)9.9%.所以最終確定磷酸化處理最佳條件為A2B2C1D2.

表4 磷酸化處理的最佳條件驗證試驗結(jié)果

2.4 小麥面筋蛋白酶解過程中水解度和蛋白提取率的變化規(guī)律

在 2.3得出的最佳條件下對小麥面筋蛋白進(jìn)行磷酸化處理,與未處理的小麥面筋蛋白作對比,其在酶解過程中水解度和蛋白提取率的變化規(guī)律見圖 5和圖 6.

圖5 小麥面筋蛋白酶解過程中水解度的變化規(guī)律

圖6 小麥面筋蛋白酶解過程中蛋白提取率的變化規(guī)律

從圖 5和圖 6可以看出,磷酸化處理和未處理的小麥面筋蛋白的水解度和蛋白提取率的變化規(guī)律都是隨酶解時間的增加而升高.但在同一時刻,經(jīng) STP磷酸化處理的小麥面筋蛋白的水解度和蛋白提取率較未處理的均有明顯提高.酶解開始后,由于處于酶的最適反應(yīng)條件下,且酶的濃度和活性都比較高,酶解反應(yīng)迅速進(jìn)行,如圖 5顯示在前 9 h內(nèi)小麥面筋蛋白的水解度增加較快.隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行,由于反應(yīng)體系中底物中用于被水解的肽鍵濃度的下降,酶解產(chǎn)物對酶解過程的抑制和整個反應(yīng)環(huán)境 pH的下降,使得酶解反應(yīng)速率下降,最終達(dá)到一個靜態(tài)平衡階段,如圖 5所示,在反應(yīng) 9 h后小麥面筋蛋白的水解度增加不明顯,基本達(dá)到平衡.

蛋白提取率是酶解結(jié)束后上清液中總氮量占原料總氮量的百分比.由于酶解過程的實質(zhì)是酶作為催化劑影響反應(yīng)的速率,本身并不參加反應(yīng),小麥面筋蛋白酶解時僅僅是蛋白質(zhì)分子中肽鍵的斷裂,體現(xiàn)在蛋白分子質(zhì)量的降低和離子性基團(tuán)的增加,所以酶解過程中蛋白提取率的變化應(yīng)該與其水解度的變化規(guī)律相同.如圖 6所示,小麥面筋蛋白酶解過程中的蛋白提取率同樣也是在 9 h內(nèi)增加較快,此后逐漸趨于平衡.

由于 STP磷酸化處理的實質(zhì)是蛋白質(zhì)的氨基酸殘基磷酸酯化,引入了大量的磷酸根基團(tuán),增加了蛋白質(zhì)體系的電負(fù)性;另外由于磷酸根離子相互作用而促進(jìn)了蛋白質(zhì) -水相互作用[8],提高了蛋白質(zhì)的溶解度,增加了有效水解位點,提高了產(chǎn)物得率,所以在同一時刻,經(jīng) STP磷酸化處理后的小麥面筋蛋白的水解度和蛋白提取率較未處理的均有明顯提高.

3 結(jié)論

(1)酶解前 STP磷酸化處理是提高小麥面筋蛋白酶解特性的有效方法.確定了小麥面筋蛋白酶解前 STP磷酸化處理的最佳條件:STP添加量為小麥面筋蛋白的 9%,溫度為 25℃,pH為 8.5,處理時間為 30 min.

(2)小麥面筋蛋白熱變性對磷酸化處理有阻礙作用.即當(dāng)溫度超過 30℃時,隨著處理溫度的升高,小麥面筋蛋白磷酸化程度逐漸下降.

(3)過高的離子強度不利于小麥面筋蛋白酶解的進(jìn)行.當(dāng) STP添加量超過小麥面筋蛋白的9%時,過高的離子強度會增大蛋白質(zhì)的疏水性,引起蛋白質(zhì)及其亞基的變性凝聚,導(dǎo)致其水解度下降.

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INFLUENCE OF STP PHOSPHATE PROCESSING ON ENZY MATIC HYDROLYSIS CHARACTER ISTICS OFWHEAT GLUTEN

ZHU Yong-sheng,WANG Jin-shui,QU Chen-ling,SU Cai-juan
(School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou450052,China)

The paper studied the influence of the STP phosphate processing on the enzymatic hydrolysis characteristics of wheat gluten before enzymatic hydrolysis using a complex protease.Through singe factor experiments and orthogonal experiments,the paper deter mined the optimal conditions:the STP amount9%,temperature 25℃,pH 8.5,and reaction ti me 30 minutes.The paper also studied the change rule of the degree of hydrolysis and the protein extraction rate of the phosphate-processed wheat gluten during hydrolysis.

phosphate processing;wheat gluten;enzymatic hydrolysis characteristics;degree of hydrolysis

TS201.2

B

1673-2383(2011)01-0031-05

2010-10-15

國家自然科學(xué)基金項目 (31071496);河南省教育廳自然科學(xué)研究計劃項目(2010A550001)

朱永勝 (1984-),男,山西壽陽人,碩士研究生,研究方向為食品生物技術(shù).

＊通信作者