不同方法篩查RhD弱表達(dá)變異體

宋任浩,魏世錦,李榮秀,張香改

(1.河北省血液中心,河北石家莊050071;2.河北省柏鄉(xiāng)縣人民醫(yī)院;3.河北省計(jì)劃生育科學(xué)研究院)

人類(lèi)紅細(xì)胞Rh血型發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)40年代,是人類(lèi)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中最具多態(tài)性者[1]。Rh血型抗原具有較強(qiáng)的免疫原性,僅次于ABO血型系統(tǒng)而具有重要的臨床意義。先后共發(fā)現(xiàn)了幾十種Rh血型蛋白抗原,與臨床相關(guān)的主要抗原為D、C、c、E和e等5種,其中以D抗原性最強(qiáng),其臨床意義也更為重要。Rh血型D抗原是導(dǎo)致產(chǎn)生Rh抗體、溶血性輸血反應(yīng)以及新生兒溶血癥的主要紅細(xì)胞抗原。根據(jù)紅細(xì)胞表面RhD抗原數(shù)的多寡,RhD陰性以外的RhD表型可分為4類(lèi):(1)常見(jiàn)表型每個(gè)紅細(xì)胞帶有1萬(wàn)-3.3萬(wàn)個(gè)抗原;(2)罕見(jiàn)的Rh缺失型;(3)D-等表型紅細(xì)胞表面RhD抗原數(shù)增加,可達(dá)7.5個(gè)萬(wàn)-20萬(wàn)個(gè);(4)RhD抗原數(shù)量減少的變異體,又可分為部分D、弱D和DEL三類(lèi)[2]。這些RhD弱表達(dá)變異體的檢測(cè)及其在輸血上的意義,也成為近年來(lái)免疫血液學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)之一[3,4],因此,我們應(yīng)用常規(guī)的RhD表型鑒定方法對(duì)278名初篩為RhD陰性的獻(xiàn)血者進(jìn)行了試驗(yàn),現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 抗球蛋白試劑(上海輸血技術(shù)有限公司,批號(hào)20080901);抗 D(IgM+IgG)單克隆抗體混合試劑(加拿大Dominion Biologicals Led公司,批號(hào)NDMG05003);1%木瓜酶試劑(長(zhǎng)春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號(hào)20090801);單克隆IgM抗D(上海市血液中心,批號(hào):20080513、20071210)單克隆IgM抗-C、IgM抗-c、IgM 抗-E、IgM抗-e(上海市血液中心,批 號(hào) 分 別 為:20071035、20080604、20080112、20090105);單克隆IgG型抗-D(Biotest公司,批號(hào):1826010;Eryclone公司,批號(hào):1538091;上海市血液中心,批號(hào):20071616、20081226)。

1.2 研究對(duì)象 來(lái)自河北省血液中心站內(nèi)、固定采血點(diǎn)和流動(dòng)采血車(chē)無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本5 8386份,初篩出278份RhD陰性,方法為微量板鹽水法,表型分布見(jiàn)表1。

1.3 研究方法 對(duì)于初篩為RhD陰性的獻(xiàn)血者標(biāo)本分別采用木瓜酶法、間接抗球蛋白法和吸收放散法篩查RhD弱表達(dá)變異體。用IgG型抗-D加RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞做陽(yáng)性對(duì)照;經(jīng)抗體篩選確定不含不規(guī)則抗體的AB型血清加2%O型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞懸液做陰性對(duì)照。試驗(yàn)選擇條件參照文獻(xiàn)[5]。

1.4 酶介質(zhì)法 3%受檢洗滌紅細(xì)胞懸液1滴與4種不同來(lái)源及規(guī)格的抗D試劑混合液2滴混合,同時(shí)做陰陽(yáng)對(duì)照。加入1%木瓜酶液1滴,120 g離心1 min,觀察結(jié)果。

1.5 間接抗球蛋白試驗(yàn)(IAT) 3%受檢洗滌紅細(xì)胞懸液1滴與4種不同來(lái)源及規(guī)格的抗D試劑2滴混合,同時(shí)做陰陽(yáng)對(duì)照。37℃/水浴孵育60 min,120 g離心1 min,生理鹽水洗滌3次,棄去生理鹽水,加抗球蛋白試劑1滴,混勻,120 g離心1 min,觀察結(jié)果,凝集為陽(yáng)性。

1.6 吸收放散試驗(yàn) IAT確認(rèn)陰性的標(biāo)本進(jìn)行吸收放散試驗(yàn)。將洗滌后的濃縮紅細(xì)胞與4種不同廠(chǎng)家及規(guī)格的抗D試劑混合液等量混合,同時(shí)做陰陽(yáng)對(duì)照。37℃水浴孵育60 min,生理鹽水洗滌6次得壓積細(xì)胞。取1體積壓積細(xì)胞加1體積生理鹽水混勻,2體積乙醚和氯仿的混合物,顛倒混勻10 min,1 300 g離心5 min,用清潔的吸管吸出底部的放散液,置37℃30 min,取上層放散液2滴加入3%O型RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞1滴,置37℃30 min,生理鹽水洗滌3次,去凈上清后加1滴抗球蛋白試劑,離心,肉眼和顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本58 386份,微量板鹽水法初篩出278份RhD陰性,RhD陰性率為0.48%。278份初篩為RhD陰性的獻(xiàn)血者標(biāo)本中,酶介質(zhì)法和IAT分別篩查出13份和15份弱D/部分D,酶介質(zhì)法比IAT少檢出兩例,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),得出酶介質(zhì)法不如IAT敏感的結(jié)論尚早,有待于大樣本的進(jìn)一步研究;在IAT確認(rèn)的RhD陰性個(gè)體中,若采用更為敏感的吸收放散試驗(yàn),仍有部分個(gè)體RhD抗原檢測(cè)為陽(yáng)性。

表1 278份初篩為RhD陰性的獻(xiàn)血者標(biāo)本弱D/部分D及DEL檢出情況

3 討論

酶試驗(yàn)有漏檢弱D/部分D的可能,因此,當(dāng)用酶試驗(yàn)檢查發(fā)現(xiàn)與抗D不凝集時(shí),不應(yīng)輕率地定為RhD陰性。但更為敏感的吸收放散試驗(yàn)檢出的弱D或部分D的臨床意義有待于進(jìn)一步研究。弱D/部分D紅細(xì)胞與某批或幾批抗-D試劑在鹽水介質(zhì)及酶介質(zhì)法中不發(fā)生凝集,但在IAT中均可發(fā)生凝集,可將IAT視為弱D/部分D的確認(rèn)試驗(yàn)?？?D試劑應(yīng)包括不同生產(chǎn)廠(chǎng)家或批號(hào)的抗-D血清3-5批。弱D/部分D型人經(jīng)輸注RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞后可產(chǎn)生抗D抗體。所以患者為弱D/部分D型時(shí)應(yīng)作RhD陰性論,應(yīng)輸RhD陰性血液;供血者為弱D/部分D型時(shí)應(yīng)作RhD陽(yáng)性論,不應(yīng)當(dāng)輸血給RhD陰性的患者。DEL型紅細(xì)胞表面D抗原數(shù)量比弱D型還要少,而且質(zhì)量上也有變化,只能通過(guò)吸收放散(adsorption and elusion)試驗(yàn)才能檢出,故名DEL[2]。對(duì)DEL型D抗原本質(zhì)的研究尚不充分,初步研究顯示某些DEL型紅細(xì)胞D抗原缺失某些表位可以產(chǎn)生抗-D[6],因此DEL型患者輸注RhD陽(yáng)性紅細(xì)胞、DEL型女性妊娠 RhD陽(yáng)性胎兒將可能面臨一定風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)外已有DEL型胎兒或紅細(xì)胞免疫RhD陰性孕婦和RhD陰性受血者由于輸入Del表型血液,而產(chǎn)生抗-D的病例報(bào)道[3,6]。但目前國(guó)際上,包括我國(guó)均不檢測(cè)DEL型,仍將其視為 RhD陰性受者或供者[7]。進(jìn)一步研究闡明DEL型的性質(zhì),對(duì)于組織血源和臨床實(shí)踐具有重要意義。Shao[8]的研究表明DEL型多見(jiàn)于亞洲人群,其在IAT確認(rèn)為RhD陰性的人群中約占10%-30%。本研究共篩查出DEL67例,在IAT確認(rèn)為RhD陰性的人群中占25.5%,與Shao的研究結(jié)果相一致,其中最主要的表型為Dccee(82%)。

RhD陰性個(gè)體RHD基因具有多態(tài)性;在中國(guó)用RHD基因分型完全替代血清學(xué)檢測(cè)RhD表型的條件尚未成熟[9],鹽水法、酶介質(zhì)法、IAT、吸收放散試驗(yàn)等常規(guī)血清學(xué)試驗(yàn)方法在篩查RhD弱表達(dá)變異體中的作用和地位不同。鹽水法不能篩查RhD弱表達(dá)變異體,但可以初篩RhD的常見(jiàn)表型,可用微板法測(cè)定,操作簡(jiǎn)單快速,市場(chǎng)上有化學(xué)改性的Ig-GRh抗血清供應(yīng)。用5種抗Rh分型血清抗C、抗c、抗D、抗E、抗e來(lái)檢查紅細(xì)胞抗原,理論上有 18種表現(xiàn)型?？寡逍r(jià)標(biāo)準(zhǔn)為抗D不低于64,其他不低于16。酶(木瓜酶或菠蘿酶)可以破壞紅細(xì)胞表面的唾液酸,使紅細(xì)胞膜失去電荷,縮小紅細(xì)胞間的距離;同時(shí)酶還可以部分地改變紅細(xì)胞結(jié)構(gòu),使某些隱蔽的抗原得以暴露,增強(qiáng)凝集性而且對(duì)IgG的作用大于IgM,故有利于不完全抗體的檢出,特別是對(duì)某些血型系統(tǒng),如Rh、Kidd系統(tǒng)的抗體特別敏感,但對(duì)MNS、Fya、Fyb等抗原決定簇有破壞作用,不能用于檢查此類(lèi)系統(tǒng),所以酶介質(zhì)法不能用作抗體檢查出的唯一方法。IAT雖較靈敏,但也有一定限度,據(jù)報(bào)告每個(gè)紅細(xì)胞上至少要有500個(gè)IgG分子才能產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng);再加上抗人球蛋白試劑的質(zhì)量及操作技術(shù)的制約,也影響其靈敏度。此外,本法操作復(fù)雜,不利于急診檢查和大批量的血庫(kù)作業(yè)。DEL型紅細(xì)胞膜D抗原非常弱,常規(guī)IAT測(cè)定為陰性,只能通過(guò)更為敏感的吸收放散試驗(yàn)才能檢出。文獻(xiàn)報(bào)告經(jīng)不同血清學(xué)方法確定的RhD陰性血樣用吸收放散試驗(yàn)篩選并確認(rèn)的DEL型所占比例不盡一致,15%(79/515)[10]至63%(47/75)[11],有待于方法學(xué)的進(jìn)一步研究。

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