產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶傷寒桿菌與痢疾桿菌bla TEM耐藥基因研究

周東輝，黃麗琴，張淑華

（1．新鋼中心醫(yī)院，江西新余 338001；2.新余學(xué)院，江西新余 338004）

產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶傷寒桿菌與痢疾桿菌bla TEM耐藥基因研究

周東輝1，黃麗琴2，張淑華1

（1．新鋼中心醫(yī)院，江西新余 338001；2.新余學(xué)院，江西新余 338004）

目的:研究新余市產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶傷寒桿菌與痢疾桿菌bla TEM-1D型耐藥基因流行特征。方法:收集新余新鋼中心醫(yī)院、新余市人民醫(yī)院、新余市中醫(yī)院、新余市婦幼保健院2008年1月—2010年6月分離出的傷寒桿菌產(chǎn)酶株6株和痢疾桿菌產(chǎn)酶株13株共19株，用頭孢哨噻吩濾紙片法做β-內(nèi)酰胺酶的定性檢測，確定為產(chǎn)酶株后，采用PCR技術(shù)擴增質(zhì)粒bla TEM-1D耐藥基因，用Mark標記量出擴增子的大小(bp)，統(tǒng)計bla TEM-1D耐藥基因陽性率。結(jié)果:傷寒桿菌、痢疾桿菌產(chǎn)酶株bla TEM-1D耐藥基因陽性率分別為66.7%（4/6）、76.9%（10/13）。結(jié)論:bla TEM-1D型耐藥基因在本地區(qū)各家醫(yī)院間存在水平傳播和醫(yī)院內(nèi)垂直傳播。

傷寒桿菌；痢疾桿菌；β-內(nèi)酰胺酶；bla TEM-1D型耐藥基因1

臨床工作中β-內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致了β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，成為腸桿菌科細菌耐藥的主要機制。本次研究是調(diào)查新鋼中心醫(yī)院、新余市人民醫(yī)院、新余市中醫(yī)醫(yī)院、新余市婦幼保健院2008年1月—2010年6月分離出的傷寒桿菌和痢疾桿菌產(chǎn)酶株bla TEM-1D型耐藥基因的分布情況，報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集上述4家醫(yī)院2008年1月—2010年6月分離出的傷寒桿菌和痢疾桿菌產(chǎn)酶株共19株（每一株至少對一種β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥）。確定為產(chǎn)酶株后，采用PCR技術(shù)擴增質(zhì)粒bla TEM-1D耐藥基因，用Mark標記量出擴增子的大小（bp）。

1.2 產(chǎn)酶株特殊耐藥表型檢測（β-內(nèi)酰胺酶檢測）采用頭孢哨噻吩濾紙片法（nitrocefin test），用接種環(huán)挑取受試菌落于商品化頭孢哨噻吩濾紙片上，于10min內(nèi)由黃色轉(zhuǎn)為紅色即為陽性，示該受試菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，即為產(chǎn)酶株。

1.3 bla TEM-1D耐藥基因檢測

1.3.1 PCR引物及儀器 根據(jù)GenBank收錄的質(zhì)粒型TEM-1D基因序列及參考伍勇等〔1〕學(xué)者設(shè)計的引物，見表1。引物由上海生工生物工程公司合成。質(zhì)粒小提取盒、PCR擴增試劑盒、2000 bpDNA Marker均為天根生化（北京）科技有限公司產(chǎn)品。PCR擴增儀為Perkin Elmer 9600。

表1 PCR所用的引物序列

1.3.2產(chǎn)酶株耐藥質(zhì)粒提起 對19株產(chǎn)酶株按質(zhì)粒小提起盒說明書提起細菌質(zhì)粒。以質(zhì)粒作為PCR模板。

1.3.3 PCR擴增 以上述19株產(chǎn)酶株的質(zhì)粒作為模板進行PCR，總反應(yīng)體積為25μL：質(zhì)粒模板1μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Mixter液12.5 μL，用去離子水補至25μL。PCR反應(yīng)循環(huán)：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃延伸5min。

1.3.4 PCR產(chǎn)物分析 用1.5%的瓊脂糖（含0.5μg/mLEB），1×TAE緩沖液中電泳，2~5 V/cm，凝膠成像系統(tǒng)照相，以2 000 bpDNA Marker（100，250，500，750，1 000，2 000 bp）為標準，分析電泳條帶bp值。

2 結(jié)果

本組試驗菌株的bla TEM型耐藥基因經(jīng)PCR擴增后的長度應(yīng)為781 bp，在Mark條帶上應(yīng)是750 bp附近，故統(tǒng)計圖1中的750 bp附近的條帶分別是：痢疾桿菌10株，傷寒桿菌4株。

圖1 bla TEM-1D型PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

3 討論

痢疾桿菌與傷寒桿菌屬于腸桿菌科細菌，而產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是腸桿菌科細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥最重要的機制之一。細菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶通過它們的活性作用位點Ser-OH對β-內(nèi)酰胺環(huán)上的羧基碳發(fā)生親核攻擊使環(huán)打開，形成通過脂鍵相連的酰酶復(fù)合物中間體，然后又能迅速水解酰酶中間體的脂鍵使酶再生，并釋放β-內(nèi)酰胺部分(已失活)，使細菌產(chǎn)生耐藥性。目前國內(nèi)外有許多關(guān)于β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌科細菌耐藥性及耐藥基因型的研究報道〔2-7〕。

有學(xué)者認為細菌對β內(nèi)酰胺酶抗生素耐藥主要是由質(zhì)粒介導(dǎo)的β內(nèi)酰胺酶所致,其中廣譜青霉素酶（TEM）是最常見的質(zhì)粒介導(dǎo)的酶,能使細菌對第一、第二代頭孢菌素耐藥。在院內(nèi)感染病人中產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)酶的耐藥菌，其產(chǎn)生耐藥性大多是在接觸抗生素后獲得的，并通過耐藥基因的轉(zhuǎn)移而播散（水平傳播），也可由基因表達而傳至下代（垂直傳播）。本次試驗顯示，本市4家醫(yī)院之間均有相同的bla TEM型耐藥基因陽性，而且同一家醫(yī)院同一個科室在不同時期有相同的bla TEM型耐藥基因陽性，提示bla TEM型耐藥基因在本地區(qū)確實存在院內(nèi)感染的水平傳播和垂直傳播。本次研究通過查閱臨床相關(guān)病歷資料發(fā)現(xiàn)痢疾桿菌與傷寒桿菌對氨芐西林的耐藥率高達94.4%，故該藥在本地區(qū)已不宜使用。第三代喹諾酮類抗生素耐藥率低，可以首選。

PCR方法是腸桿菌科耐藥菌中檢測bla TEM的快速、有效的方法〔8〕。特別是在尚不知耐藥基因流行病學(xué)情況的條件下，應(yīng)用PCR方法可以快速篩查出腸桿菌科細菌的耐藥基因型,大致了解其主要流行型別,為進一步研究提供依據(jù)。但是，本研究應(yīng)用的PCR方法只是鑒定到基因型而并未鑒定到亞型，還需應(yīng)用更多特異性的方法（如特異性引物的單一擴增、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR等技術(shù)）進行亞型鑒定。

〔1〕伍勇,徐令清,漆涌,等.大腸埃希菌質(zhì)粒介導(dǎo)頭孢菌素酶基因型研究〔J〕.臨床檢驗雜志,2007,25（6）:407-409.

〔2〕虞春華,黃瑞．沙門菌屬耐藥機制的研究進展〔J〕.微生物學(xué)免疫學(xué)進展,2008,36（03）:38-39.

〔3〕邱雄泉,黃菊,潘曉丹,等．中山地區(qū)大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌耐藥性調(diào)查〔J〕.中國醫(yī)療前沿,2008,3（14）:10-12．

〔4〕劉渠,許欣,李涌,等．沙門菌流行特點及耐藥性分析〔J〕.中外健康文摘·醫(yī)藥學(xué)刊,2008,5（2）:21-31．

〔5〕蔣火剛,李樹仁．遵義地區(qū)沙門菌、志賀菌的血清學(xué)分型及耐藥性分析〔J〕.貴州醫(yī)藥,2007,31（6）:83-84.

〔6〕楊珊明．福氏志賀菌感染161例臨床特點與耐藥性分析〔J〕.中國實用內(nèi)科雜志,2006,26（11）:865-866．

〔7〕張道平,何永貴,肖學(xué)慧,等.醫(yī)院感染性標本細菌分離的變遷調(diào)查〔J〕.中華感染學(xué)雜志,2006,16（10）:1187-1188.對策的探討〔J〕.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,1999,9（4）:193-195.

〔8〕李虹玲,劉文恩,張運麗,等.應(yīng)用多重PCR在腸桿菌科細菌中檢測blaTEM、blaSHV、blaOXA-1基因〔J〕.中國感染控制雜志,2008,7（6）:377-380.

（責(zé)任編輯 蔣 康）

Study onβ-lactamase Producing Salmonella typhi and Shigella Resistance Gene of blaTEM

ZHOU Donghui1，HUANG Liqing2，ZHANG Shuhua1
（1.Xinyu Steel Central Hospital,Xinyu,Jiangxi338001,China;2.Xinyu University,Xinyu,Jiangxi338004,China）

Objective:To study epidemiological characteristics of the β-lactamase producing Salmonella typhi in Xinyu and Shigella blaTEM-1D-type resistance gene.Methods:Isolated enzyme production strains ofSalmonellatyphi6 and Shigella 13,a total of 19 strains were collected from the Xinyu Steel Central Hospital,People's Hospital of Xinyu,Chinese Medicine Hospital of Xinyu,Maternal and Child Health Hospital of Xinyu from January 2008 to June 2010.Cephalosporins post filter papermethod was used to do thiopheneβ-lactamase qualitative detection.Affter it was defined as enzyme production strains,the lift vector plasmid was amplified by PCR blaTEM-1D resistance gene.Mark was used tomeasure the amplification the size of sub （bp length）;blaTEM-1D resistance gene-positive rate was kept.Results:Enzyme production strains ofSalmonellatyphiand Shigella blaTEM-1D resistance gene positive rates were 66.7%（4/6）,76.9%（10/13）.Conclusion:BlaTEM-1D resistance gene hasmade vertical transmission and horizontal transmission in the local hospitals.

Salmonellatyphi;shigella;β-lactamase;blaTEM-1D resistance gene

R516.3

A

1672-2345（2011）02-0022-02

2010-12-15

周東輝，主治醫(yī)師，主要從事臨床檢驗研究.