反相離子對(duì)高效液相色譜法測(cè)定硫酸奈替米星滴眼液含量

楊 帆

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院／柳州市工人醫(yī)院 藥劑科，廣西 柳州545001）

奈替米星（Netilmicin）是一種新的氨基糖苷類藥物，為半合成的氨基糖苷類抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌具有抑菌和殺菌作用，不良反應(yīng)較同類藥物小，國內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于臨床。將其制成滴眼液可用于多種細(xì)菌及耐藥菌造成的眼部感染。該類抗生素多為紫外末端吸收或無紫外吸收，故很難用紫外分光光度法直接測(cè)定其含量。中國藥典2005版采用抗生素微生物檢定法測(cè)定硫酸奈替米星含量，但該法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)。近年來也有文獻(xiàn)報(bào)道采用旋光法、柱前衍生化法、高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)法［4］等，前兩種方法受實(shí)驗(yàn)影響因素較多，后者因需對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)處理而稍顯復(fù)雜，我們建立了反相離子對(duì)高效液相色譜法直接測(cè)定其含量。通過在pH＝3.0的條件下，在1.5%的磷酸二氫鉀溶液中加入離子對(duì)試劑十二烷基硫酸鈉，被測(cè)物奈替米星與十二烷基硫酸鈉生成離子對(duì)，并用乙腈調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性，以調(diào)節(jié)出峰時(shí)間，主峰與雜質(zhì)峰分離良好。此法對(duì)硫酸奈替米星滴眼液的含量測(cè)定，取得了較滿意的結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥及實(shí)驗(yàn)條件

1.1 儀器與試藥

LC－10ATvp高效液相色譜儀，包括SPD－10Avp紫外檢測(cè)器、CLASS－VP Ver 6.12SP1工作站（日本島津公司）；UV－2401－PC紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；電子PHS－3F酸度計(jì)（上海電子光學(xué)技術(shù)研究所）；BP211D電子天平（德國賽多利斯公司）；KDC－16H高速臺(tái)式離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；0412－1離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）。注射用硫酸奈替米星（南京圣和藥業(yè)有限公司，批號(hào)：200608232青島第三制藥廠，批號(hào)070801）；硫酸奈替米星標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0355－200001）；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

（1）以1.5%磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)pH為3.0，十二烷基硫酸鈉10mmol／L）－乙腈（85：15）為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)色譜柱：Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流速：0.8mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；檢測(cè)波長：205nm。

（2）含量測(cè)定按照高效液相色譜法《中國藥典2005年版》二部附錄V附錄VD測(cè)定。色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以1.5%磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)pH 為3.0，十二烷基硫酸鈉10mmol／l）－乙腈（85：15）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為205nm。理論塔板數(shù)按硫酸奈替米星計(jì)算不低于1 500，硫酸奈替米星峰與各雜質(zhì)峰之間能良好地分離。

2 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

按本品種項(xiàng)下要求對(duì)儀器進(jìn)行系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)，應(yīng)能達(dá)到規(guī)定的要求，方能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按該色譜系統(tǒng)分析條件下色譜峰的理論塔板數(shù)、分離度、重復(fù)性應(yīng)達(dá)到要求。

色譜柱的理論塔板數(shù)（n）在所選擇的條件下，注入供試品溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分色譜峰的保留時(shí)間tR和半峰高寬（Wh／2）按n＝5.54（tR／Wh／2）2計(jì)算色譜柱的理論塔板數(shù)，經(jīng)計(jì)算所得的理論塔板數(shù)符合要求。

分離度。定量分析時(shí)，為便于準(zhǔn)確測(cè)量，要求定量峰與其他峰之間有較好的分離度，分離度（R）的計(jì)算公式為：R＝2（tR1－tR2）／（W1＋W2），式中tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間；tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間，W1和 W2為此相鄰兩峰的峰寬；根據(jù)實(shí)驗(yàn)得出的分離度大于1.5，符合要求。

重復(fù)性。取該品種項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.58%，實(shí)驗(yàn)證明重復(fù)性符合要求。

3 方法與結(jié)果

3.1 滴眼液的處方

硫酸奈替米星5.0g，硼酸10.5g，硼砂2.87g，羥苯乙脂0.3g，注射用水加至1 000mL。

3.2 滴眼液的配制

取羥苯乙脂加適量新鮮注射用水溶解后，依次加入硫酸奈替米星、硼酸、硼砂使其全部溶解，濾過，自濾器上加注射用水至全量，攪勻，除菌，分裝即得。

3.3 滴眼液含量測(cè)定

3.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn)（輔料干擾實(shí)驗(yàn)）

取處方量的輔料及注射用水按處方比例配制成輔料溶液，精密吸取2mL，加流動(dòng)相稀釋至25mL容量瓶，搖勻，過0.45μm濾膜，取20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明輔料在此條件下無吸收，對(duì)奈替米星的含量測(cè)定無干擾。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜

圖2 供試品色譜

圖3 空白輔料實(shí)驗(yàn)色譜

3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取硫酸奈替米星標(biāo)準(zhǔn)品適量（相當(dāng)于125mg），用流動(dòng)相配成5.0mg.mL－1的溶液，精密量取此溶液用流動(dòng)相稀釋成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg.mL－1的溶液，搖勻，過0.45μm濾膜，分別取20μL進(jìn)樣測(cè)得峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)回歸的直線方程為Y＝3.129×106X＋15 029，r＝0.999 8，n＝6。結(jié)果表明硫酸奈替米星在0.1～1.0mg·mL－1的濃度范圍內(nèi)，與峰面積線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)品重124.8mg，初體積25mL，初濃度4.992。

表1 硫酸奈替米星標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)曲線下濃度為0.40mg·mL－1的溶液分別在0h，1h，2h，3h，4h，8h，12h，24h測(cè)定，奈替米星在該流動(dòng)相中24h內(nèi)是穩(wěn)定的，RSD為0.84%，n＝8。

表2 硫酸奈替米星穩(wěn)定性考察 （n＝8）

3.3.4 精密度試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下濃度為0.40mg.mL－1的溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20μL，測(cè)定奈替米星的峰面積，結(jié)果RSD為0.58%。（見表3）

表3 硫酸奈替米星精密度試驗(yàn) （n＝6）

3.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，按“樣品測(cè)定”項(xiàng)下的方法測(cè)定6次，其含量測(cè)定結(jié)果的RSD為0.92%。見表4。

表4 硫酸奈替米星滴眼液含量測(cè)定重復(fù)性試驗(yàn)（n＝6）

3.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

按處方量分別配制高（120%）、中（100%）、低（80%）的硫酸奈替米星滴眼液，取樣2mL用流動(dòng)相溶解25mL容量瓶定容后，過0.45μm濾膜，各取20μL進(jìn)樣，測(cè)定奈替米星峰面積并計(jì)算回收率，測(cè)得平均回收率為100.1%，RSD為1.16%，n＝9，結(jié)果見表5。

表5 硫酸奈替米星滴眼液含量測(cè)定回收率實(shí)驗(yàn)

3.3.7 樣品含量測(cè)定

取硫酸奈替米星滴眼液2mL，用流動(dòng)相稀釋后配成0.4mg·mL－1的溶液；另取硫酸奈替米星標(biāo)準(zhǔn)品適量，用流動(dòng)相配成0.4mg.mL－1的溶液。分別取上述溶液20μL進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。三批樣品測(cè)定結(jié)果分別為100.9%、98.1%和99.7%。

表6 硫酸奈替米星滴眼液的含量測(cè)定

4 討論

（1）測(cè)定波長的選擇：取硫酸奈替米星標(biāo)準(zhǔn)品適量，用流動(dòng)相溶解后，以流動(dòng)相為空白，在190～400nm波長范圍內(nèi)掃描，硫酸奈替米星在205nm波長處有較大吸收峰，選擇205nm波長為測(cè)定波長。同時(shí)選用較低背景吸收的乙腈作為流動(dòng)相中的有機(jī)相時(shí)，基線穩(wěn)定，對(duì)測(cè)定無干擾。

（2）色譜柱的選擇：反相離子對(duì)色譜法要求盡可能選擇表面覆蓋度高且疏水性強(qiáng)的鍵合相，如C8或C18鍵合相。長鏈烷基可使溶質(zhì)的k增大，分離選擇性改善，使載樣量提高，長鏈烷基鍵合相的穩(wěn)定性也更好。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的Diamonsil C18柱為分析色譜柱。且本實(shí)驗(yàn)條件流動(dòng)相的pH值較低，而Diamonsil C18柱的pH適用范圍也較廣（1.5～8.0），故該柱符合實(shí)驗(yàn)要求并能得到較好的分離效果。

（3）流動(dòng)相的選擇：反相鍵合相色譜法中，流動(dòng)相一般以極性最強(qiáng)的水為基礎(chǔ)溶劑，加入甲醇、乙腈等極性調(diào)節(jié)劑。由于在檢測(cè)波長205nm處甲醇的吸光度較乙腈大許多，檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生的噪音過大，而且甲醇的黏度也比乙腈大，會(huì)產(chǎn)生過高的柱壓，故選擇乙腈作為調(diào)節(jié)劑。乙腈比例越大，流動(dòng)相的洗脫能力越強(qiáng)，奈替米星的容量因子就越小，保留時(shí)間也越短，直接影響到主峰與雜質(zhì)的分離效果。本實(shí)驗(yàn)選取1.5%磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)pH為3.0）－乙腈（85：15）為流動(dòng)相，并用此流動(dòng)相作為溶媒溶解樣品使得用高效液相色譜法直接測(cè)定硫酸奈替米星含量成為可能，且輔料在此條件下無吸收，樣品在此流動(dòng)相中穩(wěn)定性良好。

（4）氨基糖苷類抗生素多為紫外末端吸收或無紫外吸收，該類抗生素用HPLC法進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)多采用柱前衍生化法。但衍生化反應(yīng)影響因素多，增加了方法的系統(tǒng)誤差而且操作繁瑣。本文建立了奈替米星質(zhì)量控制的有效方法。

［1］陳新謙.新編藥物學(xué)［M］.第15版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：79.

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