活血化瘀方中黃芪不同劑量對抗氧化作用的影響

丁焦生

（焦作市第二人民醫(yī)院 腎內(nèi)科，河南 焦作454000）

腎臟是人體重要器官，許多實驗研究已證實氧化應(yīng)激在腎臟損傷中的重要作用。氧化應(yīng)激作為一種致病介質(zhì)參與各種原因?qū)е碌哪I功能衰竭的發(fā)病過程［1］。因此抗氧化治療可以明顯減緩腎臟疾病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展［2－3］。活血化瘀方劑具有活血通絡(luò)、改善和調(diào)整血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的作用?；钛鰪?fù)方中大量使用黃芪已成為慣例。

黃芪又名黃耆、戴椹、獨椹、蜀脂等，為豆科植物蒙左黃芪和膜夾黃芪的根，始載于《本經(jīng)》［4］，列為上品。古人用其“主治肌表之水也，故能治黃汗、盜汗、皮水。又旁治身體腫或不仁者?！苯?jīng)芪芍桂枝苦酒湯、防己茯苓湯、黃芪桂枝五物湯等驗證，其對“身體、四肢腫，水氣在皮膚中，汗出惡風(fēng)，汗沾衣，色正黃如蘗汁，身體不仁，暮盜汗，腰髖弛痛”［5］有較好療效。但是盲目大量使用黃芪，也可導(dǎo)致較為明顯副作用［6］。為充分開發(fā)、利用我國豐富的藥用植物資源，本實驗分析了自擬活血化瘀方劑中不同劑量黃芪組方對抗氧化作用的影響，以探討黃芪適宜的使用劑量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

益氣活血方由黃芪、當(dāng)歸、丹參、白術(shù)、茯苓等組成，藥物飲片均為廣州康臣藥業(yè)有限公司提供，黃芪按60g、30g、15g不同劑量分別與當(dāng)歸15g、丹參15g、白術(shù)12g、茯苓12g等配伍。加10倍水將藥物浸泡1h，煮沸后再煎1.5h，紗布過濾；二煎加水8倍。煮沸后再煎1h，紗布過濾。兩煎相合水浴濃縮，分別制得黃芪含量不同的A、B、C 3種藥劑，使?jié)舛扔谩癵生藥表達形式”為0.8g生藥／mL，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。試驗用胎牛肝、腎等組織取自廣州增城奶牛場。其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

Analyst AD酶標(biāo)儀（美國 MD公司）；LDZ4－1.2低速離心機（北京精力離心機有限公司）；Sartorius BS224S／CB－25A電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；雷磁PHSJ－4A／JFP－8酸度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DK2／CB253電熱恒溫震蕩水槽（上海一恒科技有限公司）。

1.3 藥物及試劑的配置

藥物濃度：0.8g生藥／mL，組織濃度：100g／L勻漿，紅細(xì)胞濃度：5%。

1.4 對牛腎自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響

新生小牛處死后，迅速取腎臟，裝入冰盒帶回實驗室，在0℃～4℃下用生理鹽水制成100g／L的組織勻漿。實驗分為空白組：不給任何藥物；模型對照組：單純給予造模而不給藥物；給藥A、B、C的實驗組：非別給予中藥A藥液、B藥液、C藥液；維生素E對照組。每組平行5管，每管加組織勻漿1mL，不同濃度藥液0.2mL，混勻。37℃溫育2h，按硫代巴比妥酸（TBA）法［7］測丙二醛（MDA）含量。結(jié)果見表1。

1.5 對H2O2誘導(dǎo)牛腎脂質(zhì)過氧化的影響

同前法制備100g／L腎勻漿，分組同上。先在各管中加入100g／L腎勻漿1mL，各濃度藥液0.2mL，37℃溫育振蕩反應(yīng)15min，再向各管中加入100mmol／L H2O20.1mL，繼續(xù)溫育反應(yīng)30min，各管加入200g／L三氯乙酸1.5mL終止反應(yīng)，以10 000g離心10min，取上清液，加入P＝6.7g／L的TBA1.5mL，并于沸水中水浴15min，同上測定 MDA的含量。結(jié)果見表2。

1.6 對H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血的影響

取小牛全血，用肝素抗凝，用生理鹽水（5min×2 000g）離心洗滌后，配成5%的紅細(xì)胞懸液，分組同上，將紅細(xì)胞懸液1.0mL加入各濃度給藥組和對照組的試管中，對照組給予等量生理鹽水，將試管37℃溫育10min后，加50mmol／L H2O20.5mL繼續(xù)溫育1h，稀釋5倍后離心（5min×2 000g），取上清液在530nm處測吸光值，以紅細(xì)胞在對照組中的溶血率為100%，計算紅細(xì)胞溶血率。結(jié)果見表3。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 對牛腎自發(fā)性脂質(zhì)過氧化和H2O2誘導(dǎo)牛腎脂質(zhì)過氧化的影響

實驗結(jié)果顯示，模型組MDA含量明顯升高。與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）；A藥組、B藥組、C藥組、維生素E組能明顯降低MDA含量，與模型組比較均有顯著性差異（P＜0.01）；A、C藥組降低 MDA含量作用弱于B藥組（表1、表2）。

表1 對牛腎自發(fā)性脂質(zhì)過氧化各組MDA含量

表2 對H2O2誘導(dǎo)牛腎脂質(zhì)過氧化物MDA的含量

2.2 對H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血的影響

實驗結(jié)果顯示，活血化瘀中藥組方體外能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血。A藥組、B藥組、C藥組、維生素E組能明顯抑制溶血，與模型組比較均有顯著性差異，A、C藥組作用弱于B藥組（表3）。

表3 各組對H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血的影響

3 討論

自由基化學(xué)上也稱為“游離基”，是含有一個不成對電子的原子團。自由基因為帶有單數(shù)電子，具有高度的氧化活性，它們極不穩(wěn)定，活性極高，它們攻擊細(xì)胞膜、線粒體膜，與膜中的不飽和脂肪酸反應(yīng)，造成脂質(zhì)過氧化增強。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物又可分解為更多的自由基，如此一再重復(fù)，引起自由基的連鎖反應(yīng)。MDA和SOD、CAT、GSH－Px是目前公認(rèn)的反應(yīng)氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)［8］。正常情況下，機體生理代謝過程中即可產(chǎn)生自由基，但體內(nèi)也存在相應(yīng)的自由基清除酶，如產(chǎn)生與清除間動態(tài)平衡，則不發(fā)生自由基連鎖反應(yīng)和組織損傷。但過剩會損傷細(xì)胞膜，使DNA斷裂、蛋白質(zhì)變性及酶失活，導(dǎo)致細(xì)胞解體和死亡。空氣污染、日光、輻射、藥物或不當(dāng)飲食，也會使身體產(chǎn)生自由基。自由基氧化損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、毛細(xì)血管基底膜和腦細(xì)胞，造成毛細(xì)血管通透性增高和細(xì)胞功能障礙。生成大量的脂質(zhì)過氧化物，其中最主要的是MDA。MDA含量可反應(yīng)其損傷程度。氧自由基是肝腎缺血性損傷的重要因素［9］。因此，尋找利于人體吸收的抗氧化劑及自由基清除劑，目前正成為人們關(guān)注的重點。

體外誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化損傷模型為觀察藥物清除自由基提供了有效的手段。體外誘導(dǎo)試驗中H2O2為反應(yīng)提供了大量活性氧化劑，誘發(fā)多不飽和脂肪酸氧化，形成過氧化脂質(zhì)或引起紅細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化、膜蛋白發(fā)生聚集，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，所以能夠通過測定MDA和紅細(xì)胞溶血程度可判斷自由基的多少。本實驗結(jié)果顯示，模型組MDA含量明顯升高，與歷年的有關(guān)文獻報道相一致；B藥組及維生素E組MDA含量明顯降低，與模型組比較，有顯著性意義，30g黃芪配伍組具有較好的抗氧化、保護組織的作用。A藥組也能使MDA含量降低，但作用不如30g黃芪配伍組。而15g黃芪配伍組抗氧化作用較弱。本實驗結(jié)果提示在治療腎臟疾病的活血化瘀復(fù)方配伍中，黃芪的用量宜大，其抗氧化效應(yīng)明顯強于小劑量，但隨著其劑量的增大，抗氧化效應(yīng)反而減弱。本實驗結(jié)果證明在此活血化瘀方中黃芪用量以30g左右為宜，為黃芪在臨床中的應(yīng)用提供了證據(jù)。

［1］紫強.二氧化硫?qū)π∈竽I臟的氧化損傷作用［J］.工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，2004，30（1）：29.

［2］LEE H B.Reactive oxygen species as glucose signaling molecules in mesangial cells cultured under high glucose［J］.Kidney Int，2000，58（Suppl 77）：S19－25.

［3］Y，YANG Y，HA H，LEE G T，et al.Role of reactive oxygen species in TGF－betal－induced mitogen－activated protein kinase activation and epithelial mesenchymal transition in renal tubular epithelial cells［J］.J Am Soc Nephrol，2005，16：667－675.

［4］《中華本草》編委會.中華本草［M］.上海：上海科技出版社，1995：341－355.

［5］曹丙章.中國醫(yī)學(xué)大成（十）［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，1997：256－257.

［6］耿鑒庭.黃芪的臨床應(yīng)用與研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合雜志，1989，9（6）：327.

［7］陳奇編.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.第1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：941.

［8］ELENA ALANO，ALBERTO M，et al.Identification and characterization of human MT5－MMP，a new membranebound activator of progelatinase A over－expressed in brain tumors［J］.Cancer RES，1999：2570.

［9］HESS ML，MANSON NH.Molecular oxygen：Friend or foe.The role of the oxygen free radical system in the calcium paradox，the oxygen paradox and ischemia／reperfusion injury［J］.J Mol Cell Card／o／，1984，16（11）：969.