復(fù)方大青葉注射液對(duì)體外培養(yǎng)HT-H9細(xì)胞CXCR4啟動(dòng)子活性的影響*

冷 弘，劉慧濤，臧玉翠，馬云云，李 敏，靳 靜，趙國強(qiáng)#

1)洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室洛陽471000 2)南陽油田總醫(yī)院消化腎病科南陽473132 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室鄭州450001 4)河南省職工醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室鄭州451191

(2011-04-24收稿 責(zé)任編輯 王 曼)

大青葉是我國傳統(tǒng)中藥，屬于十字花科草本植物，味苦、性寒，具有清熱、解毒和涼血之功效，所含化學(xué)成分有靛藍(lán)、靛玉紅、色氨酮、3-羥苯基喹唑酮及有機(jī)酸類等。大青葉具有抗炎抗病毒和提高免疫力等作用［1］，在抗流感、柯薩奇、乙型腦炎、單純皰疹及扁平疣等病毒方面效果顯著［2-6］。獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(HIV)所引起的傳染性疾病，在病毒感染過程中，CD4+T細(xì)胞是被攻擊的主要靶細(xì)胞，而 CXCR4則是HIV感染CD4+T細(xì)胞的關(guān)鍵輔助受體［7］。近年來，以輔助受體為靶點(diǎn)的抗AIDS藥物成為一個(gè)新的藥物設(shè)計(jì)目標(biāo)，在HIV感染的早期階段起重要作用。作者以CXCR4啟動(dòng)子為靶點(diǎn)，構(gòu)建其熒光素酶報(bào)告載體，轉(zhuǎn)染人T淋巴細(xì)胞系HT-H9細(xì)胞，觀察大青葉注射液對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面CXCR4基因啟動(dòng)子活性的影響，為復(fù)方大青葉注射液在抗AIDS方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人T淋巴細(xì)胞系HT-H9細(xì)胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。GloMax?96微孔發(fā)光檢測(cè)儀、pGEM-T Easy克隆載體、熒光素酶報(bào)告基因載體 pGL4.17、4 ×dNTP、X-gal、IPTG、E4550 熒光素酶檢測(cè)試劑盒購自Promega公司;T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶 KpnⅠ、NheⅠ、Marker DL2000均購自TaKaRa公司;DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司;G418、脂質(zhì)體購自Invitrogen公司;復(fù)方大青葉注射液由山東華信制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)09081002，規(guī)格2 mL/支。

1.2 目的基因的克隆及鑒定 按照GenBank中 發(fā)表的FJ642475 CXCR4啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物，分別加入KpnⅠ和NheⅠ酶切位點(diǎn)，上游引物:5’-CGG TACCAAGCACTATTCGCGAATTGGTTAC-3’，下游引物:5’-TGCTAGCGGTAACCGCTGGTTCTCCAGA-3’。引物由上海生工生物公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為876 bp。取健康志愿者靜脈血，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取人基因組 DNA。PCR擴(kuò)增體系:10×buffer 5μL，上、下游引物各0.5 mL，高保真 Taq酶 2 U，4×dNTP 2 μL，人基因組DNA 2μL，去離子水補(bǔ)足50μL;反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，循環(huán)25次;72℃延伸5 min。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證片段大小。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后直接與pGEM-T Easy載體進(jìn)行連接，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，篩選陽性克隆，抽提重組質(zhì)粒pGEM-T-CXCR4，經(jīng)PCR和雙酶切消化鑒定。

1.3 重組報(bào)告載體的構(gòu)建 酶切報(bào)告基因載體pGL4.17和重組質(zhì)粒pGEM-T-CXCR4，得到線性化的載體與目的基因，膠回收雙黏片段，采用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，接種于含氨芐的LB平板，篩選陽性菌落，獲得陽性報(bào)告載體pGL4.17-CXCR4。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，并進(jìn)一步測(cè)序確證。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HT-H9細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前以3×105個(gè)/孔接種于24孔板上，用脂質(zhì)體法分別將質(zhì)粒pGL4.17及 pGL4.17-CXCR4轉(zhuǎn)入 HT-H9細(xì)胞，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2和飽和濕度下培養(yǎng)，經(jīng)800 mg/L G418篩選2周獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，然后在200 mg/L G418壓力下擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 復(fù)方大青葉注射液作為成藥，其原液含生藥質(zhì)量濃度為1 000 g/L，根據(jù)其成人推薦臨床用量(2～4 mL/次，1～2次/d)折算出細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)應(yīng)的等效劑量，按照成人60 kg體質(zhì)量折算，用注射用水稀釋，分高劑量與低劑量，換算后細(xì)胞培養(yǎng)的劑量分別為100 mg/L和200 mg/L。分別以用高、低劑量復(fù)方大青葉注射液處理的轉(zhuǎn)染細(xì)胞為高、低劑量實(shí)驗(yàn)組，以未加任何處理的轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對(duì)照組，以注射用水處理的轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為注射水對(duì)照組，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染的HT-H9細(xì)胞作為未轉(zhuǎn)染對(duì)照組。每組各設(shè)10個(gè)復(fù)孔，在相應(yīng)條件下處理24 h后進(jìn)行熒光素酶活性測(cè)定。

1.6 熒光素酶活性檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，離心去培養(yǎng)液，PBS洗滌后收集細(xì)胞，按照E4550熒光素酶檢測(cè)試劑盒操作說明，每孔加入150μL Cell Culture Lysis Reagent裂解細(xì)胞，室溫作用15 min，吸取20 μL裂解后的液體至96孔板，用GloMax96微孔發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)各組熒光素酶熒光值。每孔重復(fù)測(cè)3次，取平均值作為該孔細(xì)胞熒光素酶活性值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用 SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)，5組熒光素酶活性的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒p GEM-T-CXCR4的鑒定 CXCR4啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增片段與預(yù)期相符(圖1)。將擴(kuò)增產(chǎn)物插入pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，獲得陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，電泳結(jié)果顯示重組質(zhì)粒大小與計(jì)算理論值大小一致(圖2)。

2.2 p GL4.17-CXCR4的鑒定 將CXCR4啟動(dòng)子序列亞克隆入 pGL4.17載體，篩選陽性克隆采用KpnⅠ/NheⅠ雙酶切鑒定，電泳結(jié)果符合預(yù)期大小，證實(shí)啟動(dòng)子序列正確插入(圖3)。測(cè)序結(jié)果證明重組的pGL4.17-CXCR4序列與設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列完全一致。

2.3 各組細(xì)胞熒光素酶活性檢測(cè) 見表1。

表1 各組CXCR4熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果

3 討論

復(fù)方大青葉注射液屬于中成藥，以大青葉為主，輔以金銀花、羌活、拳參、大黃配制而成，其藥物活性成分及作用靶點(diǎn)眾多，抗病毒效應(yīng)的作用機(jī)制也十分復(fù)雜，是常用的清熱解毒類中藥。在已有的大青葉抗病毒研究中，劉盛等［2］發(fā)現(xiàn)大青葉注射液對(duì)流感病毒有直接抑制作用;李小青等［8］發(fā)現(xiàn)大青葉注射液對(duì)柯薩奇病毒引起的小鼠病毒性心肌炎效果明顯，能夠有效改善和保護(hù)心肌細(xì)胞;喬鳳霞［9］采用大青葉注射液治療單皰病毒性角膜炎，療效顯著;高?。?］自制乙腦合劑(大青葉、石膏、知母等)聯(lián)合西藥治療重癥乙腦，療效優(yōu)于單純西藥治療。上述研究結(jié)果表明大青葉注射液在抗病毒方面作用廣泛。

CXCR4與CCR5屬于趨化因子受體家族成員，與相應(yīng)配體結(jié)合參與體內(nèi)多種生理病理進(jìn)程(如白細(xì)胞趨化、免疫調(diào)節(jié)及新生血管形成)，參與細(xì)胞增殖和代謝等。CXCR4與CCR5是HIV-Ⅰ感染CD4+T細(xì)胞的關(guān)鍵輔助受體［10］，在HIV-Ⅰ進(jìn)入靶細(xì)胞過程中起重要作用。輔助受體拮抗劑的開發(fā)成為抗AIDS治療的重大突破［11］。目前已有的 CXCR4拮抗劑中，AMD070正處于Ⅱ期臨床研究階段，KRH-1636在阻斷HIV-Ⅰ的復(fù)制方面效果明顯［12］。既然輔助受體的封閉能夠達(dá)到阻止HIV感染及其在細(xì)胞間的傳播作用，下調(diào)二者的表達(dá)理論上應(yīng)能夠阻止HIV入侵宿主細(xì)胞，達(dá)到有效防治AIDS的目的［13］。作者通過復(fù)方大青葉注射液對(duì)體外培養(yǎng)HT-H9細(xì)胞中CXCR4啟動(dòng)子活性作用的觀察，了解其是否能夠通過作用于CXCR4啟動(dòng)子，下調(diào)CXCR4蛋白的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗AIDS活性。

作者首先構(gòu)建了含人CXCR4啟動(dòng)子的熒光素酶表達(dá)載體 pGL4.17-CXCR4，以其轉(zhuǎn)染 HT-H9細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性，以此來觀察CXCR4啟動(dòng)子的表達(dá)。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組熒光素酶平均值均大于15 000，遠(yuǎn)高于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，說明載體構(gòu)建成功，且啟動(dòng)子調(diào)控后續(xù)基因表達(dá)，熒光素酶基因得以激活，檢測(cè)熒光素酶活性可以代表CXCR4啟動(dòng)子活性。復(fù)方大青葉注射液高劑量實(shí)驗(yàn)組和低劑量實(shí)驗(yàn)組的熒光素酶熒光值明顯低于空白對(duì)照組，提示復(fù)方大青葉注射液可以降低體外培養(yǎng)的HT-H9細(xì)胞CXCR4啟動(dòng)子活性，減少CXCR4啟動(dòng)子的表達(dá)，具有潛在的抗HIV-Ⅰ的作用。

在腫瘤研究領(lǐng)域，2001年 Muller等［14］首次報(bào)道CXCR4和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，隨后越來越多的研究［15-17］表明CXCR4與多種腫瘤遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)。因此，復(fù)方大青葉注射液是否能通過降低CXCR4的表達(dá)，以達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)以及減少轉(zhuǎn)移的目的，也值得進(jìn)一步探討。

總之，復(fù)方大青葉注射液作為一種毒副作用小、價(jià)格低廉的傳統(tǒng)中藥，深入研究其作用機(jī)制，充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，在AIDS和腫瘤的防治上必將有非常廣闊的發(fā)展前景。

［1］張淑杰，趙紅，顧定偉，等.大青葉水煎劑對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的體外研究［J］.中國公共衛(wèi)生，2003，19(9):1091

［2］劉盛，陳萬生，喬傳卓，等.不同種質(zhì)板藍(lán)根和大青葉的抗甲型流感病毒作用［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21(3):204

［3］劉釗，楊占秋，肖紅.中藥大青葉有效單體抗柯薩奇病毒作用［J］.中南民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，28(2):41

［4］高巍.中西醫(yī)結(jié)合治療重癥乙型腦炎43例［J］.陜西中醫(yī)，2002，23(2):116

［5］喻淑慶，陳湘漪，余凌.大青葉提取物抗單純皰疹病毒Ⅱ型的體外實(shí)驗(yàn)研究［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，27(4):394

［6］朱玉雙，孫步民，陳莉.大青葉湯治療扁平疣100例［J］.中醫(yī)外治雜志，2005，14(2):23

［7］ Bleul CC，Wu L，Hoxie JA，et al.The HIV coreceptors CXCR4 and CCR5 are differentially expressed and regulated on human T lymphocytes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(5):1925

［8］李小青，張國成，許東亮，等.黃芪和大青葉治療小鼠病毒性心肌炎的對(duì)比研究［J］.中國當(dāng)代兒科雜志，2003，5(5):439

［9］喬鳳霞.大青葉注射液治療單皰病毒性角膜炎［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，11(13):1224

［10］Deng HK，Liu R，Ellmeier W，et al.Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1［J］.Nature，1996，381(6584):661

［11］Wilkin A，F(xiàn)einberg J.New targets in antiretroviral therapy 2006［J］Curr Opin HIV AIDS，2006，1(5):437

［12］廖紹蘭，王平.新的抗艾滋病藥物——趨化因子受體拮抗劑的研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)藥:抗生素分冊(cè)，2008，29(2):58

［13］衛(wèi)艷萍，馮龍，馬云云，等.以人 CCR5啟動(dòng)子為靶的藥物篩選方法的初步建立［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2009，26(5):1043

［14］Muller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis［J］.Nature，2001，410(6824):50

［15］Sun X，Cheng G，Hao M，et al.CXCL12/CXCR4/CXCR7 chemokine axis and cancer progression［J］.Cancer Metastasis Rev，2010，29(4):709

［16］Arya M，Ahmed H，Silhi N，et al.Clinical importance and therapeutic implications of the pivotal CXCL12-CXCR4(chemokine ligand-receptor)interaction in cancer cell migration［J］.Tumor Biol，2007，28(3):123

［17］Wang J，He L，Combs CA，et al.Dimerization of CXCR4 in living malignant cells:control of cell migration by a synthetic peptide that reduces homologous CXCR4 interactions［J］.Mol Cancer Ther，2006，5(10):2474