地塞米松和1，25-(OH)2 D3對EC1細胞增殖和細胞周期的影響*

張 震，付 聰，王冰一，竇蒙蒙，趙繼敏，黃幼田，趙明耀#

1)鄭州大學臨床醫(yī)學系鄭州450001 2)鄭州大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室鄭州450001

(2010-12-31收稿 責任編輯 李沛寰)

地塞米松(dexamethasone，DEX)和活性維生素1，25-(OH)2D3是臨床和實驗中使用的腫瘤誘導分化劑，分屬類固醇類激素和非類固醇類激素兩大家族，前者的受體是在細胞質(zhì)內(nèi)，后者的受體是在細胞核內(nèi)。它們作為配體在轉(zhuǎn)錄因子的基因表達調(diào)控上有明顯的不同。作者觀察了這2種藥物單獨及聯(lián)合使用對食管鱗狀細胞癌EC1細胞的增殖與細胞周期的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑和細胞 RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(天津 TBD 公司)，DEX、1，25-(OH)2D3、RNase、MTT 和 DMSO(美國 Sigma公司)，EC1細胞(鄭州大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室惠贈)。DEX和1，25-(OH)2D3均采用無水乙醇溶解，配置成10－4mol/L儲存液，使用時用培養(yǎng)液稀釋成相應的工作濃度。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組 EC1細胞在含體積分數(shù)為10% 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞匯合至70%～80%時，用胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液。①溶劑對照組:體積分數(shù)0.1%的無水乙醇作用EC1細胞。②DEX組:用10－7mol/L DEX處理EC1 細胞。③1，25-(OH)2D3組:用 10－7mol/L 1，25-(OH)2D3處理EC1細胞。④聯(lián)合用藥組:10－7mol/L DEX 和 10－7mol/L 1，25-(OH)2D3處理 EC1細胞。各組細胞經(jīng)藥物作用48、72和96 h后，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 EC1細胞增殖抑制實驗 采用MTT法。將制成的單細胞懸液，按1.5×104L－1的密度分別接種到3塊96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h;按1.2分組分別加藥處理細胞，每組設3個復孔，再分別培養(yǎng)48、72和96 h;每孔加入5 g/L的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;吸去上清，加入200μL DMSO，室溫下振蕩10 min使紫色結晶全部溶解，在96孔酶標儀上以空白對照孔調(diào)零，570 nm處讀取吸光度(A)值。

1.4 EC1細胞周期檢測 應用流式細胞儀法。于3塊6孔培養(yǎng)板每孔接種約2.5×105個細胞，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，棄去無血清培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入新RPMI 1640完全培養(yǎng)基，并進行實驗分組，分別作用48、72和96 h。將各組細胞用2 g/L胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄去上清;用PBS洗2遍，離心后棄上清，加入體積分數(shù)為70%的冰乙醇固定，4℃過夜;上機前1 000 r/min離心5 min，棄去乙醇，PBS洗3遍;加入1 mL PBS制成細胞懸液，加入5 g/L RNaseA 10μL，室溫放置1 h;調(diào)整細胞濃度為1×106/管，加入100 mg/L碘化丙啶液50μL，避光30 min，上機每個樣本檢測10 000個細胞周期的改變，計算處于G0/G1期EC1細胞比率。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 10.0進行分析。采用2×2×3析因設計的方差分析比較各組EC1細胞增殖與細胞周期的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 DEX和1，25-(OH)2D3及聯(lián)合用藥對 EC1細胞形態(tài)的影響 與溶劑對照組比較，藥物作用96 h后，DEX組、1，25-(OH)2D3組及聯(lián)合用藥組 EC1細胞生長緩慢，均未見細胞死亡現(xiàn)象(圖1)。

圖1 藥物作用96 h各組EC1細胞的形態(tài)(×200)A:溶劑對照組;B:DEX組;C:1，25-(OH)2 D3組;D:聯(lián)合用藥組。

2.2 DEX 和1，25-(OH)2D3對 EC1細胞增殖和細胞周期G0/G1期的影響 見表1。

表1 DEX 和1，25-(OH)2D3對 EC1細胞增殖和細胞周期G0/G1期的影響(n=3)

3 討論

根據(jù)腫瘤的正負信號調(diào)控理論，細胞癌變是因為調(diào)控細胞生長正信號分子過多而負信號分子過少，導致腫瘤細胞出現(xiàn)高增殖、低分化及低凋亡等生物學特征。而腫瘤的誘導分化治療，是在誘導分化劑的作用下，使腫瘤細胞被誘導，重新向正常細胞方向分化，表現(xiàn)為細胞生長、形態(tài)、基因表達和生物標志物接近正常細胞狀態(tài)。地塞米松通過細胞質(zhì)內(nèi)受體發(fā)揮作用，體內(nèi)大多數(shù)組織存在地塞米松受體，因此地塞米松的作用非常廣泛。臨床上應用大劑量的糖皮質(zhì)激素抗炎、抗過敏、抗免疫排斥反應和抗休克［1］。研究［2-3］表明糖皮質(zhì)激素與腫瘤有著密切的關系，該激素對肝癌、卵巢癌等腫瘤細胞有抑制增殖和誘導分化作用。1，25-(OH)2D3除了具有鈣磷代謝的功能之外，還是一種細胞周期調(diào)節(jié)劑，影響細胞的增殖、分化和凋亡，在前列腺癌、結腸癌等腫瘤治療中表現(xiàn)出明確的誘導分化作用［4-5］。

作者采用1，25-(OH)2D3單獨或與 DEX聯(lián)合作用于EC1細胞，均顯示對EC1細胞增殖的抑制效果。相關研究［6-9］顯示，在細胞內(nèi) 1，25-(OH)2D3首先與高親和力的特異性受體VDR發(fā)生結合，與配體結合的VDR再與視黃酸X受體形成異源二聚體后，即可與靶基因上游的維生素D反應元件結合形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復合體，從而激活或抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄、表達，從而調(diào)控 p53、pRb、p21、p27等腫瘤相關基因的表達。而糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生的抑制增殖，使細胞周期阻滯在G0/G1期的信號是通過p21/WAF1的表 達 完 成 的［10］。該 研 究 結 果 顯 示，1，25-(OH)2D3單獨或與DEX聯(lián)合將EC1細胞周期阻滯于G0/G1期，并且2種藥物在這兩個作用上具有交互效應，提示這2藥可能均通過p21/WAF1而發(fā)揮細胞周期G0/G1期阻滯作用。進一步探討其中機制有助于提高細胞誘導分化劑抗腫瘤效應。

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