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    FAK shRNA抑制白血病BCR/ABL-BaF3細(xì)胞生長*

    2011-09-14 06:46:44許呂宏方建培翁文駿
    中國病理生理雜志 2011年11期
    關(guān)鍵詞:激酶白血病載體

    許呂宏, 方建培, 翁文駿, 潘 莉

    (中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院兒科,廣東廣州510120)

    化學(xué)藥物治療是白血病治療的主要手段之一,成人白血病化療后5年生存率約40%,兒童白血病化療后5年生存率約80%[1]。BCR/ABL基因是人體細(xì)胞第9號染色體ABL原癌基因與第22號染色體BCR基因相互易位形成的融合基因,可引起蛋白激酶持續(xù)性活化,是白血病不良預(yù)后因素之一[2]。臨床發(fā)現(xiàn)有部分患者對該化療藥物不敏感,出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象,應(yīng)用分子靶向治療是解決該問題的新策略。黏著斑激酶(focal adhesion kinase,F(xiàn)AK)是一種細(xì)胞內(nèi)非受體型酪氨酸激酶。FAK基因定位于人染色體8q24,編碼1 052個氨基酸,其蛋白質(zhì)分子量為125 kD。研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)AK在正常細(xì)胞的生長周期、增殖分化、遷移運動及血管生成等過程均發(fā)揮重要作用;并且,F(xiàn)AK在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),在腫瘤細(xì)胞激活過程及侵襲轉(zhuǎn)移中也起關(guān)鍵作用,漸成為目前腫瘤治療的新靶點[3,4]。本實驗擬應(yīng)用 BCR/ABL-BaF3白血病細(xì)胞株為研究對象,構(gòu)建FAK shRNA慢病毒載體,通過體外及動物體內(nèi)實驗研究FAK基因沉默對白血病細(xì)胞生長的影響。

    材料和方法

    1 材料及動物

    BCR/ABL-BaF3白血病細(xì)胞株由美國哈佛大學(xué)波士頓兒童醫(yī)院Le Yi博士惠贈。RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自Invitrogen,抗FAK單克隆抗體購自 Upstate,抗 β-actin、STAT5、p-STAT5、caspase-3、caspase-9單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology,甲基纖維素半固體培養(yǎng)基MethoCult? M3630購自Stem Cells。無特定病原體(SPF級)BALB/c小鼠,雄性,6-8周,體重18-20 g,由中山大學(xué)北校區(qū)實驗動物中心提供并飼養(yǎng)。

    2 FAK shRNA轉(zhuǎn)染

    按照文獻(xiàn)[5]方法,應(yīng)用含綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因的慢病毒載體,插入FAK shRNA序列,經(jīng)篩選得到最有效的FAK shRNA序列是5’-GGAATGCTTCAAGTGTGCT-3’。體外應(yīng)用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)BCR/ABL-BaF3白血病細(xì)胞株,分別將FAK shRNA或空白對照的慢病毒轉(zhuǎn)染至該細(xì)胞株中,流式細(xì)胞儀分選轉(zhuǎn)染后GFP陽性細(xì)胞用于實驗研究。

    3 Western blotting檢測

    流式分離轉(zhuǎn)染后GFP陽性的BCR/ABL-BaF3細(xì)胞,應(yīng)用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。分別取蛋白100 μg上樣,經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至二氟化樹脂(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜,PVDF膜用5% 脫脂奶室溫封閉2 h。分別加入1∶200 I抗(抗 FAK、β-actin、STAT5、p-STAT5、caspase-3、caspase-9等單克隆抗體),4 ℃輕搖過夜。TBS洗膜3次后加1∶5 000 II抗(山羊抗小鼠IgG),室溫平衡1 h。TBS洗膜3次后ECL顯色。應(yīng)用專門的圖像分析軟件計算顯影的強(qiáng)度。

    4 白血病細(xì)胞生長及集落培養(yǎng)

    4.1 體外細(xì)胞增殖生長 流式細(xì)胞儀分選GFP陽性白血病細(xì)胞于體外培養(yǎng),取2×105白血病細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,每天計算細(xì)胞數(shù)量的增殖情況。

    4.2 細(xì)胞集落培養(yǎng) 取5×102白血病細(xì)胞重懸于100 μL PBS緩沖液,然后置于1 mL甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系進(jìn)行集落培養(yǎng),在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,計數(shù)白血病細(xì)胞集落,以細(xì)胞數(shù)大于40個為一個集落。

    5 FAK shRNA抑制白血病生成

    5.1 白血病動物模型的建立 調(diào)整轉(zhuǎn)染后BCR/ABL-BaF3白血病細(xì)胞濃度至5 ×1010/L,取1×106(0.2 mL)白血病細(xì)胞經(jīng)尾靜脈輸注到BALB/c小鼠體內(nèi)。取含F(xiàn)AK shRNA白血病細(xì)胞組為實驗組,不含F(xiàn)AK shRNA白血病細(xì)胞為對照組,每組小鼠15只。

    5.2 白血病生成檢測 每天觀察小鼠的生存情況,記錄死亡時間,繪制生存曲線。白血病細(xì)胞輸注后第25 d,分別處死5個小鼠(實驗組和對照組),分離小鼠脾臟,比較脾臟腫大情況,流式細(xì)胞儀檢測脾臟中GFP陽性細(xì)胞表達(dá)率。

    6 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,應(yīng)用t檢驗或單因素方差分析;繪制Kaplan-Meier生存曲線并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗,檢驗水準(zhǔn)設(shè)α=0.05。

    結(jié) 果

    1 Western blotting檢測蛋白表達(dá)水平

    含F(xiàn)AK shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染至白血病細(xì)胞為FAK基因沉默組,不含F(xiàn)AK shRNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞為空白載體對照組,分別應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測GFP陽性百分比,結(jié)果示2組的轉(zhuǎn)染率為21%-32%,差異無顯著(P>0.05)。如圖1所示,與空白載體對照組相比,F(xiàn)AK shRNA能明顯抑制細(xì)胞FAK蛋白水平的表達(dá),見圖1A。FAK shRNA對細(xì)胞內(nèi)STAT5蛋白表達(dá)無顯著影響,而明顯降低STAT5蛋白磷酸化水平,見圖1B。FAK shRNA可引起細(xì)胞內(nèi)caspases-3活化,見圖1C,而對caspases-9的活化無顯著影響,見圖1D。

    Figure 1.Western blotting analysis protein expression and caspases activity.A:FAK expression;B:STAT5 phosphorylation;C:caspase-3activation;D:caspase-9 activation.±s.n=3.**P<0.01 vs vector group.圖1 Western blotting檢測蛋白表達(dá)水平及caspase活性

    2 體外實驗中FAK shRNA抑制細(xì)胞生長

    分別取2×105空白載體對照組及FAK shRNA組的白血病細(xì)胞體外培養(yǎng)3 d,每天計算細(xì)胞數(shù)量的增殖情況。如圖2所示,第24 h,空白載體對照組與FAK shRNA組細(xì)胞計數(shù)分別為(2.60±0.26)×105和(2.16±0.28)×105,2組差異無顯著(P>0.05);第48 h,空白載體對照組與FAK shRNA組細(xì)胞計數(shù)分別為(4.50±0.50)×105和(3.43±0.32)×105,2組差異顯著(P<0.05);體外培養(yǎng)第72 h,2組細(xì)胞計算分別為(8.13±0.61)×105和(5.20±0.53)×105,2組差異顯著(P<0.01),提示 FAK shRNA能抑制細(xì)胞生長。另外,取5×102白血病細(xì)胞于甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系中培養(yǎng)7 d,集落計數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn),空白載體對照組與FAK shRNA組中集落數(shù)量分別為215.60±13.01和125.00±9.06,2組差異顯著(P<0.01),提示FAK shRNA抑制細(xì)胞集落形成。

    Figure 2.Cell growth and colony formation in vitro.A:cells growth in RPMI-1640 medium for 72 h;B:colony formation in methylcellulose medium for 7 d.±s.n=3.*P < 0.05,**P < 0.01 vs vector group.圖2 體外實驗中細(xì)胞生長及集落形成情況

    3 動物體內(nèi)實驗示FAK shRNA抑制白血病細(xì)胞生長

    取1×106BCR/ABL-BaF3白血病細(xì)胞經(jīng)尾靜脈輸注到BALB/c小鼠體內(nèi)建立白血病動物模型。生存分析顯示,空白載體對照組的小鼠于白血病細(xì)胞輸注的第21-27 d全部死亡,生存中位數(shù)是24 d;而FAK shRNA組小鼠于白血病細(xì)胞輸注的第52-60 d全部死亡,生存中位數(shù)是55 d,2組差異顯著(P<0.05),見圖3A。白血病細(xì)胞輸注后第25 d分離小鼠脾臟,發(fā)現(xiàn)白血病小鼠脾臟比正常小鼠脾臟明顯腫大;與空白載體對照相比,F(xiàn)AK shRNA能明顯減輕脾臟腫大,見圖3B??瞻纵d體對照組與FAK shRNA組小鼠脾臟中GFP陽性細(xì)胞百分比分別為(82.40±6.13)%和(14.50±3.70)%,2組差異顯著(P<0.01)。結(jié)果表明FAK shRNA能抑制白血病細(xì)胞生長。

    討 論

    Figure 3.FAK shRNA inhibits the growth of BCR/ABL-BaF3 cells in vivo.A:survival curves of mice after injection of BCR/ABL-BaF3 cells;B:leukemic mice developed splenomegaly on day 25,but FAK silencing reduced the size of spleen compared with the vector.The volume of spleen in normal group,vector group and FAK shRNA group was(0.22±0.07)cm3,(1.60±0.25)cm3and(0.51±0.12)cm3,respectively.n=3.圖3 動物體內(nèi)實驗示FAK shRNA抑制白血病細(xì)胞生長

    BaF3細(xì)胞是一種來源于小鼠前B淋巴細(xì)胞的白血病細(xì)胞株,體外培養(yǎng)依賴細(xì)胞因子IL-3;而轉(zhuǎn)染BCR/ABL基因的BaF3細(xì)胞的生長不需細(xì)胞因子IL-3[6]。本實驗應(yīng)用BCR/ABL-BaF3細(xì)胞株作為研究對象,應(yīng)用RNA干擾技術(shù)將FAK基因沉默,研究FAK shRNA對白血病生長的影響。體外實驗結(jié)果表明FAK shRNA能抑制白血病細(xì)胞生長及集落形成。本實驗將BCR/ABL-BaF3白血病細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射到BALB/c小鼠體內(nèi),成功建立白血病動物模型。動物體內(nèi)實驗證實FAK shRNA能抑制白血病生成,延長白血病動物模型的生存時間。我們實驗結(jié)果說明FAK shRNA能明顯抑制白血病細(xì)胞生長。

    FAK在正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的生命活動中發(fā)揮重要作用。臨床研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)AK與白血病的進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)。國外有研究分析60例急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)的血液標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)42%白血病細(xì)胞高表達(dá) FAK蛋白及 mRNA,46%CD34+白血病細(xì)胞表達(dá)FAK蛋白[7]。最近有研究也分析36例AML病例,發(fā)現(xiàn)患者腫瘤細(xì)胞中FAK蛋白高表達(dá)則其預(yù)后相對較差,說明FAK是影響白血病患者生存率的重要因素之一[8]。Shahzad 等[9]研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)AK shRNA能增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性,并通過caspase-3蛋白酶誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。最近國內(nèi)也有學(xué)者關(guān)注FAK基因在白血病細(xì)胞的表達(dá)及意義。有學(xué)者應(yīng)用酪氨酸激酶抑制劑處理K562白血病細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)隨著化療藥物濃度增加,K562細(xì)胞內(nèi)FAK mRNA表達(dá)逐漸降低,提示該化療藥物可能通過降低FAK mRNA表達(dá)而抑制白血病細(xì)胞增殖[10]。研究結(jié)果提示FAK基因可作為白血病治療的新靶點。

    FAK在細(xì)胞生長中扮演重要角色,有研究表明FAK介導(dǎo)細(xì)胞生存的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有:(1)PI-3K-PKB-Bad-GSK3。FAK結(jié)構(gòu)中Tyr397位點的磷酸化可激活PI-3K激酶,進(jìn)而活化第二信使PI(3,4,5)P3 和 PI(3,4)P2,最終活化磷脂蛋白酶PKB。PKB活化后通過滅活一系列細(xì)胞凋亡蛋白如Bad、GSK3 等而提供細(xì)胞生存信號[11]。(2)Src-p130CAS-Ras-JNK。細(xì)胞外基質(zhì)與FAK介導(dǎo)的生存信號可通過Src使p130CAS磷酸化,激活Ras信號及JNK[12]。(3)阻斷腫瘤抑制因子p53信號。研究發(fā)現(xiàn)FAK的N端能與p53分子N端相結(jié)合,兩者相互作用能降低p53分子的轉(zhuǎn)錄活性,阻斷凋亡蛋白的信號,促使細(xì)胞獲得生存信號[13]。有關(guān) FAK shRNA治療白血病的作用機(jī)制尚未明確,我們既往研究發(fā)現(xiàn)FAK shRNA能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡[5]。本實驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)FAK shRNA能明顯降低STAT5蛋白磷酸化水平,并引起caspases-3的活化,提示FAK shRNA作用途徑可能與STAT5及caspases-3有關(guān)。BCR/ABL基因是人體細(xì)胞第9號染色體ABL原癌基因與第22號染色體BCR基因相互易位形成的融合基因,可引起FAK蛋白激酶持續(xù)性活化[14]。本實驗結(jié)果提示通過FAK基因沉默能抑制BCR/ABL基因的成瘤性,具體分子信號通路仍有待深入探討。

    綜上所述,F(xiàn)AK shRNA能抑制FAK蛋白表達(dá),體外實驗發(fā)現(xiàn)FAK shRNA抑制白血病細(xì)胞生長,動物體內(nèi)實驗也證實FAK shRNA能抑制白血病生成,為FAK基因沉默治療白血病提供實驗基礎(chǔ)。

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