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    利多卡因?qū)H-SY5Y 細(xì)胞的損傷作用*

    2011-12-23 04:07:56文先杰徐世元雷洪伊鄭雪琴楊承祥
    中國(guó)病理生理雜志 2011年11期
    關(guān)鍵詞:麻藥神經(jīng)細(xì)胞利多卡因

    文先杰, 徐世元, 雷洪伊, 梁 樺, 鄭雪琴, 楊承祥

    (1 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院麻醉科,廣東 廣州510282;2 佛山市第一人民醫(yī)院麻醉科,廣東 佛山528000)

    局麻藥在臨床常用濃度下也可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷,表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞的腫脹、退行性變,神經(jīng)脫髓鞘、空泡癥、染色體溶解、細(xì)胞程序性死亡等。暫時(shí)性神經(jīng)病學(xué)綜合征(transient neurological syndrome,TNS)和馬尾綜合征是臨床上常見局麻藥神經(jīng)毒性反應(yīng)[1]。SH-SY5Y 細(xì)胞株來源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤,該細(xì)胞繁殖快,細(xì)胞形態(tài)、生理和系列化功能與正常神經(jīng)細(xì)胞相似,因此該細(xì)胞是進(jìn)行人類神經(jīng)細(xì)胞研究較為理想的一種細(xì)胞模型[2]。本研究在SH-SY5Y 細(xì)胞體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,采用MTT 法和流式細(xì)胞儀技術(shù),觀察了不同濃度利多卡因?qū)H-SY5Y 細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡的影響,初步探討利多卡因的神經(jīng)毒性損傷作用。

    材 料 和 方 法

    1 材料

    鹽酸利多卡因標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海公司,Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BIPEC,SH-SY5Y 細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。主要儀器包括全自動(dòng)酶標(biāo)儀(雷勃公司),分光光度計(jì)(GBC),流式細(xì)胞儀(BD)等。

    2 方法

    2.1 SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)液內(nèi)(含有4.0 mmol/L 谷氨酰胺、4.5 g/L 的葡萄糖、100 mg/L 鏈霉素和100 U/L 青霉素),置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至約90%時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

    2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 實(shí)驗(yàn)分為4 組,即:正常培養(yǎng)組(對(duì)照組,未經(jīng)藥物處理);0.5%、1%、2%利多卡因組(L1、L2、L3 組,相當(dāng)于18.5 mmol/L、37 mmol/L、74 mmol/L 利多卡因處理細(xì)胞):分別用相應(yīng)濃度的利多卡因處理SH-SY5Y 細(xì)胞10 min。

    2.3 觀察指標(biāo)

    ①SH-SY5Y 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 藥物處理10 min 后,在可見光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),評(píng)價(jià)細(xì)胞受損情況。

    ②MTT 法檢測(cè)SH-SY5Y 細(xì)胞相對(duì)活力 分別在藥物處理后5 min(T1)、10 min(T2)、藥物處理結(jié)束后15 min(T3)、藥物處理結(jié)束后12 h(T4)將細(xì)胞接種于96 孔板中,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞濃度為5 ×105cells/well,每孔加入MTT 溶液(5 g/L)10 μL,37 ℃繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入DMSO 150 μL,振蕩10 min 使結(jié)晶充分溶解,于酶標(biāo)儀檢測(cè)A570及A630值,計(jì)算A570與A630差值,并以正常培養(yǎng)組的差值1,其它各時(shí)點(diǎn)差值與其比值(%)為反映細(xì)胞活力的參數(shù)。

    ③細(xì)胞凋亡檢測(cè) 分別在藥物處理開始前(T0)、藥物處理后5 min(T1)、10 min(T2)、藥物處理結(jié)束后15 min(T3)、藥物處理結(jié)束后12 h(T4)將各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5 ×108cells/well,接種于96 孔培養(yǎng)板,每孔加入細(xì)胞懸液100 μL ,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h 時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。取SH-SY5Y 細(xì)胞,置于離心管中,以離心半徑10 cm、1 500 r/min 離心5 min,收集懸浮細(xì)胞。PBS 洗滌細(xì)胞2次后,以離心半徑10 cm、1 500 r/min 離心5 min,然后收集細(xì)胞。用400 μL 1 ×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液移至樣品試管中,加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻后于避光條件下室溫24 ℃孵育15 min。加入碘化丙啶10 μL,使終濃度為50 mg/L,染色5 min,24 ℃避光30 min 后,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔,每孔重復(fù)測(cè)定3 次,取平均值。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,組間比較采用單因素方差分析。

    結(jié) 果

    1 細(xì)胞形態(tài)改變

    倒置顯微鏡下見正常培養(yǎng)SH-SY5Y 細(xì)胞胞體粗大,呈多角形,出現(xiàn)樹突狀突起,神經(jīng)突起,多而粗大,分布成網(wǎng)絡(luò),表現(xiàn)出一系列神經(jīng)元的特征。實(shí)驗(yàn)組不同濃度的利多卡因處理10 min 后均對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞形態(tài)有明顯影響,細(xì)胞變圓,回縮,軸突漸消失,見圖1。

    Figure 1. Morphocytology of SH-SY5Y cells (×100). C:SH-SY5Y were cultured under normal conditions;L1:SH-SY5Y were cultured with 0.5% lidocaine for 10 min;L2:SH-SY5Y were cultured with 1% lidocaine for 10 min;L3:SH-SY5Y were cultured with 2% lidocaine for 10 min.圖1 SH-SY5Y 細(xì)胞形態(tài)

    2 細(xì)胞活力

    各實(shí)驗(yàn)組不同濃度的利多卡因?qū)H-SY5Y 細(xì)胞活力均有明顯影響,利多卡因處理5 min 后,各組細(xì)胞活力明顯下降,且隨劑量增加,細(xì)胞活力下降明顯增加。2%利多卡因處理5 min 后,細(xì)胞活力下降至67%,處理10 min 后,細(xì)胞活力則下降為61%,停止利多卡因處理后15 min,細(xì)胞活力繼續(xù)下降至53%,停止處理后12 h,細(xì)胞活力則恢復(fù)至65%,見表1。

    表1 各組SH-SY5Y 細(xì)胞活力的比較Table 1. Cell viability of the SH-SY5Y cells in each group(%. ±s.n=6)

    表1 各組SH-SY5Y 細(xì)胞活力的比較Table 1. Cell viability of the SH-SY5Y cells in each group(%. ±s.n=6)

    T1:treatment for 5 min;T2:treatment for 10 min;T3:15 min after treatment;T4:12 h after treatment. * P <0. 05 vs control group;#P <0.05 vs L1 group;△P <0.05 vs L2 group;▲P <0.05 vs T1 group.

    Group T1 T2 T3 T4 Control 100 100 100 100 L1 87 ±2* 79 ±4*▲ 70 ±4*▲ 81 ±3*▲L2 77 ±4* # 68 ±4* #▲ 61 ±3* #▲ 74 ±3* #L3 67 ±5* #△ 61 ±5* #△▲53 ±4* #△▲ 65 ±4* #△

    3 細(xì)胞凋亡率

    對(duì)照組細(xì)胞凋亡率在各時(shí)點(diǎn)保持在5.9% ~6.3%之間,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在利多卡因處理后各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡率明顯增加,且隨著濃度的增加,細(xì)胞凋亡率也增加。2%利多卡因處理5 min、10 min 及停止利多卡因處理后15 min、12 h,細(xì)胞凋亡率分別為15.5%、23.0%、22.7%和19.3%,見表2。

    表2 各組SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡率的比較Table 2. Apoptotic rate of the SH-SY5Y cells in each group (%. ±s.n=6)

    表2 各組SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡率的比較Table 2. Apoptotic rate of the SH-SY5Y cells in each group (%. ±s.n=6)

    T0:before treatment. * P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs L1 group;△P <0.05 vs L2 group;▲P <0.05 vs T0 group;OP <0.05 vs T1 group.

    Group T0 T1 T2 T3 T4 Control 6.2 ±0.5 6.1 ±0.4 6.5 ±0.5 6.1 ±0.4 6.2 ±0.4 L1 6.3 ±0.5 10.4 ±1.3*▲ 15.0 ±0.4*▲O 14.5 ±1.5*▲O 9.6 ±1.7*▲L2 6.2 ±0.4 14.1 ±1.2* #▲ 19.2 ±1.2* #▲O 19.8 ±1.3* #▲O 15.2 ±0.5* #▲L3 5.9 ±0.4 15.5 ±0.9* #▲ 23.0 ±1.8* #△▲O 22.7 ±1.7* #△▲O 19.3 ±1.0* #△▲

    討 論

    局麻藥對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性與其劑量、濃度和作用時(shí)間相關(guān),即使在臨床常用濃度下,也常導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷,導(dǎo)致的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)與感覺功能損害多數(shù)在數(shù)小時(shí)或數(shù)天可完全恢復(fù),少數(shù)恢復(fù)時(shí)間更長(zhǎng),甚至為不可逆性。一項(xiàng)多中心研究發(fā)現(xiàn),TNS 的發(fā)病率約為8.1%,表現(xiàn)為椎管內(nèi)阻滯完全恢復(fù)后早期出現(xiàn)燒灼樣、持續(xù)固定、痙攣性、放射性疼痛的癥狀,多發(fā)于軀干下部、一般為雙側(cè),可沿下肢放射至其末端或背部[1]。馬尾綜合征發(fā)病率遠(yuǎn)低于TNS,但通常為永久性損害,表現(xiàn)為椎管內(nèi)阻滯恢復(fù)后,持續(xù)性肛周、骶尾區(qū)、雙下肢感覺和運(yùn)動(dòng)功能障礙。

    局麻藥的神經(jīng)毒性作用的機(jī)制目前尚不完全明確,可能與以下幾方面有關(guān)。(1)神經(jīng)元興奮性增加[3-5]。局麻藥引起的暫時(shí)性神經(jīng)病學(xué)綜合征則表現(xiàn)為傳入神經(jīng)元興奮性增加引起的向雙下肢放射的臀部神經(jīng)病理性疼痛。研究表明,利多卡因可以使神經(jīng)細(xì)胞膜上的鈉離子通道發(fā)生重排,使細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度及細(xì)胞膜上鈉電流增加,神經(jīng)細(xì)胞的興奮性增加。(2)細(xì)胞內(nèi)鈣超載[6-8]。細(xì)胞內(nèi)鈣超載可導(dǎo)致線粒體膜電位的破壞和功能障礙,線粒體腫脹,功能失調(diào),導(dǎo)致細(xì)胞死亡。鈣超載可使一些酶激活,引起膜磷脂的分解,在分解過程中產(chǎn)生游離脂肪酸、前列腺素、白三烯、溶血磷脂等,均對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。(3)p38 MAPK 途徑[9,10]。p38 MAPK的激活是細(xì)胞凋亡性死亡的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑。研究表明,布比卡因神經(jīng)毒性損傷與p38 MAPK 的激活有關(guān)。

    本研究選擇利多卡因的濃度分別為0.5%、1%和2%,均為臨床上常用的神經(jīng)阻滯濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,臨床常用濃度的利多卡因也可導(dǎo)致離體培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。本研究采用的是離體細(xì)胞培養(yǎng)模型,與在體研究存在比較大的差異。在整體實(shí)驗(yàn)中,制備局麻藥神經(jīng)損傷模型則需要較高濃度的利多卡因,通常達(dá)到5% ~10%,這可能與在體受多種因素如細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、神經(jīng)元的種類等因素影響有關(guān)。關(guān)于利多卡因的在體神經(jīng)損傷及其機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。但局麻藥神經(jīng)毒性損傷已經(jīng)成為神經(jīng)阻滯的常見不良反應(yīng),且與局麻藥的濃度密切相關(guān),因此在臨床工作中,在滿足臨床需要的同時(shí),應(yīng)采用最低有效濃度,盡可能減少局麻藥的神經(jīng)毒性作用。

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