中醫(yī)補(bǔ)益法優(yōu)化干預(yù)結(jié)腸癌輔助治療階段的實(shí)驗研究

葉 曄 阮善明 沈敏鶴 宋巧玲 陳美雪 林 紅 任函承

(1中國計量學(xué)院，浙江省杭州市下沙經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)學(xué)源街，310018;2浙江省中醫(yī)院)

結(jié)腸癌(Colon Carcinoma)是一種常見的消化道腫瘤，其發(fā)病率居惡性腫瘤的第4位［1］。由于當(dāng)前臨床應(yīng)用的結(jié)腸癌化療方案均存在療效差、緩解率低、毒副反應(yīng)重和患者耐受性差等問題，ⅢC、IV期結(jié)腸癌五年生存率分別僅為44.3%和8.1%［2］，目前公認(rèn)的治療方法是以手術(shù)為主的綜合治療。近年來，中醫(yī)藥在結(jié)腸癌的輔助治療中有較好的療效，尤其是在化療增敏減毒［3］，治療結(jié)腸癌并發(fā)癥［4－5］、控制癥狀［6］、延長疾病進(jìn)展時間、生活質(zhì)量［7］等方面均有顯著療效，但是目前國內(nèi)外在對中醫(yī)藥在化療期間介入時機(jī)的選擇中，尚未有明確的方案。益元湯為浙江省中醫(yī)院沈敏鶴主任醫(yī)師在長期臨證中總結(jié)改進(jìn)的補(bǔ)益法驗方，由黃芪、生曬參、豬苓、茯苓、枸杞子、女貞子等組成，我們通過建立人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞裸鼠移植性腫瘤的實(shí)驗?zāi)Ｐ?，初步評價及探討中醫(yī)補(bǔ)益法優(yōu)化協(xié)同化療治療結(jié)腸癌的有效性及作用機(jī)制。

1 實(shí)驗材料

1.1 實(shí)驗動物 Balb/c－nu裸鼠，雄性，體重22～24g，5～6周齡，購于上海西普爾－必凱實(shí)驗動物有限公司，實(shí)驗動物使用許可證號:syxk(滬)2008－0058。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗中心無特定病原體動物(SPF)級環(huán)境下，室內(nèi)定期進(jìn)行紫外線照射，籠具、墊料、飲水、飼料等均嚴(yán)格消毒。

1.2 藥物與主要試劑 中醫(yī)補(bǔ)益法方劑:采用益元湯，由生藥材黃芪30g，生曬參30g，豬苓30g，茯苓30g，枸杞子15g，女貞子15g組成。先用10倍生藥重量的蒸餾水浸泡1h，武火煎沸后改文火煎1h，用8層紗布過濾取出藥汁，再加入8倍水，文火煎30min，過濾取汁，收集兩次煎劑，棄去藥渣，文火濃縮成1.25g/mL(200mL)，分裝至無菌玻璃瓶內(nèi)，并沸水浴內(nèi)煮30min，冷卻后4℃冰箱冷藏。化療藥選用5－Fu。細(xì)胞選用購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫的LoVo人結(jié)腸癌細(xì)胞系，主要細(xì)胞培養(yǎng)試劑有購自Gibco公司的胎牛血清(FBS)與F－12K培養(yǎng)基等。免疫組化試劑主要有購自Santa Curz公司的兔抗鼠Bcl－2抗體、Bax抗體與購自Diaclone公司的DAB染色試劑盒等。

1.3 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗儀器:Thermo公司的5%CO2培養(yǎng)箱HEPA class100，北京醫(yī)用離心機(jī)廠的自動平衡離心機(jī)LDZ5－2，重慶光電公司的倒置顯微鏡等。動物實(shí)驗儀器:手術(shù)剪、止血鉗鑷、眼科剪鑷、注射器、小鼠灌胃器、游標(biāo)卡尺等。免疫組化實(shí)驗儀器:MICROM公司的STP120脫水機(jī)、AP280－2包埋機(jī)、HM335E切片機(jī)，Nikon公司的Nikon eclipse 80i顯微鏡，Carl Zeiss公司的Carl Zeiss Imaging Systems等。

2 實(shí)驗方法

2.1 LoVo細(xì)胞的培養(yǎng) 人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系LoVo，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的F－12K培養(yǎng)基中，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞接種24h后進(jìn)入指數(shù)增長期。隔天換液傳代。

2.2 皮下移植模型的建立 取對數(shù)生長期的Lovo細(xì)胞，以0.25%胰酶消化離心后用生理鹽水稀釋，計數(shù)板計數(shù)將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107/mL的細(xì)胞懸液;用1mL注射器抽取0.2mL(2×106/只)細(xì)胞懸液，接種于小鼠左側(cè)腋下皮下，共70只。造模結(jié)束后觀察小鼠狀態(tài)良好，無局部出血等。細(xì)胞移植后第7天觀察小鼠，將未成瘤者剔除，并隨機(jī)抽取荷瘤小鼠60只。

2.3 實(shí)驗分組 將60只成功造模的裸鼠用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為6組:中醫(yī)補(bǔ)益法優(yōu)化干預(yù)組(分提前干預(yù)化療組，同步干預(yù)化療組和延后干預(yù)化療組)，化療組、中醫(yī)補(bǔ)益法中藥組和模型組(簡稱提前干預(yù)組，同步干預(yù)組，延后干預(yù)組，化療組，中藥組和模型組)，每組10只。

2.4 給藥方法與劑量 細(xì)胞移植后，模型組不使用任何藥物干預(yù)，第15～21天以生理鹽水灌胃?；熃M于第15～21天予5－Fu腹腔注射;中藥組于第15～21天以中藥灌胃;提前干預(yù)組，于第8～14天以中藥灌胃，第15～21天予5－Fu腹腔注射;同步干預(yù)組于第15～21天予5－Fu腹腔注射的同時予中藥灌胃;延后干預(yù)組于第15～21天予5－Fu腹腔注射，第22～28天以中藥灌胃。5－Fu:用生理鹽水稀釋為1mg/mL，0.25mg/10g;益元湯:0.15mL/10g;生理鹽水:0.15mL/10g。

2.5 標(biāo)本采集及處理 細(xì)胞移植后第29天，即全部用藥結(jié)束24h后，每組眼球放血法處死裸鼠5只，剝?nèi)∑は铝鰤K，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋瘤塊。

2.6 主要觀察指標(biāo) 一般情況觀察;腫瘤體積、瘤重、抑瘤率和生存期;免疫組化分析凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2、Bax的表達(dá)與圖象分析。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 將收集到的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0版本統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

3 實(shí)驗結(jié)果

3.1 一般情況觀察 造模成功后開始每日觀察其攝食、攝水、活動狀態(tài)和腫瘤生長等變化。60只小鼠接種初期活躍如常，攝食攝水等活動如常，體形無明顯改變;6周左右逐漸出現(xiàn)消瘦，行動遲緩，精神萎靡，攝食量少，瘤塊壞死脫落;從第75天開始逐漸出現(xiàn)死亡。裸鼠接種2～3天可見皮下接種部位白色細(xì)胞聚集小點(diǎn)，1周時已形成瘤塊，可見瘤塊為圓形或橢圓形，瘤徑約3mm×5mm，2周后逐漸不規(guī)則，3周后瘤塊表面凹凸不平，或出現(xiàn)局部浸潤生長，第29天處死一半裸鼠時可見瘤塊與局部皮膚、肌肉緊密粘連，較難分離，未見肝、肺、脾等臟器轉(zhuǎn)移。第5周瘤徑約為10mm×10mm，5周后可見瘤塊附近皮下血管明顯，新生血管形成，6周后逐漸出現(xiàn)消瘦、瘤塊壞死脫落。晚期15周左右瘤塊壞死腐爛嚴(yán)重。

3.2 腫瘤體積 造模成功后，即皮下注射人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo第8天，觀察皮下瘤塊生長情況，此后每天觀察1次，直至第29天處死荷瘤裸鼠。采集的組織標(biāo)本用游標(biāo)卡尺測量瘤徑，計算腫瘤體積。模型組的平均體積最大，為(507.2±14.5)mm3，其余依次為中藥組、化療組、同步干預(yù)組、提前干預(yù)組、延后干預(yù)組(見表1)。除中藥組外，其余不同藥物干預(yù)組的腫瘤體積均與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);且延后干預(yù)組與化療組比較也有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組平均腫瘤體積(s，n=5)

表1 各組平均腫瘤體積(s，n=5)

注:與模型組比較，*P＜0.05;與化療組比較，△P＜0.05。

組別 腫瘤體積(mm3)507.2±14.5化療組 478.2±8.3*中藥組 505.8±19.9提前干預(yù)組 454.8±26.7*同步干預(yù)組 465.2±15.8*延后干預(yù)組 446.0±20.8模型組＊△

3.3 瘤重和抑瘤率 細(xì)胞移植后第29天，即全部用藥結(jié)束24h后，采集的組織標(biāo)本平均重量和抑瘤率見表2。模型組的平均瘤重最大，為0.53±0.04g，其余依次為中藥組、化療組、同步干預(yù)組、提前干預(yù)組、延后干預(yù)組。除中藥組、化療組外，其余不同藥物干預(yù)組的瘤重與模型組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，延后干預(yù)組與化療組比較也有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組平均瘤重和抑瘤率(s，n=5)

表2 各組平均瘤重和抑瘤率(s，n=5)

注:與模型組比較，*P＜0.05;與化療組比較，△P＜0.05。

組別 平均瘤重(g)抑瘤率(%)模型組18.87%0.53±0.04化療組 0.49±0.02 7.55%中藥組 0.52±0.03 1.89%提前干預(yù)組 0.46±0.04* 13.21%同步干預(yù)組 0.46±0.03* 13.21%延后干預(yù)組 0.43±0.03＊△

3.4 生存期 模型組于第75天逐漸出現(xiàn)死亡，平均生存期為89.20±8.61天;延后干預(yù)組平均生存期最長，為130.00±18.47天;其余各組生存期見表3。除中藥組與化療組外，其余不同藥物干預(yù)組的生存期與模型組比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提前干預(yù)組、延后干預(yù)組與化療組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組平均生存期(s，n=5)

表3 各組平均生存期(s，n=5)

注:與模型組比較，*P＜0.05;與化療組比較，△P＜0.05。

組別 平均生存期(天)89.20±8.61化療組 101.40±9.01中藥組 96.60±11.93提前干預(yù)組 116.80±12.05＊△同步干預(yù)組 112.80±12.46*延后干預(yù)組 130.00±18.47模型組＊△

3.5 免疫組化分析凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2、Bax的表達(dá)水平 Bcl－2為Bcl－2蛋白家族中的抗凋亡蛋白，具有BH1－4結(jié)構(gòu)域，主要存在于線粒體膜上，可以抑制細(xì)胞凋亡，但卻不能促進(jìn)細(xì)胞增殖［8］。模型組的Bcl－2平均光密度最大，為0.263±0.008;延后干預(yù)組平均光密度最小，為0.215±0.010;其余各組的平均光密度值見表4。提前干預(yù)組、延后干預(yù)組的Bcl－2平均光密度均與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，延后干預(yù)組與化療組比較也有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表4 各組凋亡相關(guān)蛋白的平均光密度(s，n=5)

表4 各組凋亡相關(guān)蛋白的平均光密度(s，n=5)

注:與模型組比較，*P＜0.05;與化療組比較，△P＜0.05。

0.263±0.008 0.182±0.010化療組 0.248±0.017 0.198±0.016中藥組 0.259±0.007 0.180±0.007提前干預(yù)組 0.225±0.019* 0.224±0.023*同步干預(yù)組 0.243±0.018 0.209±0.008*延后干預(yù)組 0.215±0.010＊△ 0.249±0.035 Bcl－2 Bax模型組組別＊△

Bax為Bcl－2蛋白家族中的促凋亡蛋白，可與抗凋亡蛋白Bcl－2形成異源二聚體，具有抑制Bcl－2的功能。模型組的Bax平均光密度最小，為0.182±0.010;延后干預(yù)組平均光密度最大，為0.249±0.035;其余各組的平均光密度值見表4。除中藥組和化療組外，其余不同藥物干預(yù)組的Bax平均光密度與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，延后干預(yù)組與化療組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

4 討論

近年來，中醫(yī)藥在結(jié)腸癌的輔助治療中有較好的療效，對其作用機(jī)理的研究與探討不斷增多。益元湯之“元”字意為元?dú)?，而沈敏鶴主任醫(yī)師認(rèn)為元?dú)庥腥?，即上焦一身之氣，中焦后天水谷之氣，下焦腎精所化之氣，三者構(gòu)成元?dú)?，主持人體正常生理功能，缺一不可。故在益元湯組方配伍中三者兼顧。黃芪、生曬參補(bǔ)肺氣(上焦之氣，一身之氣)，豬苓、茯苓補(bǔ)脾胃之氣(后天之氣、中焦之氣)，枸杞子、女貞子補(bǔ)肝腎之精氣(先天之氣、下焦元?dú)?，上、中、下三焦之氣充盈，共臻外邪可御，內(nèi)疾不起之效。本實(shí)驗結(jié)果顯示:中醫(yī)補(bǔ)益法協(xié)同化療治療LoVo人結(jié)腸癌移植性裸鼠的生存期比化療組有所延長，延后干預(yù)組和提前干預(yù)組較之同步干預(yù)組有更大的生存獲益趨勢，延后干預(yù)組較之提前干預(yù)組有更大的生存獲益趨勢。中醫(yī)補(bǔ)益法協(xié)同化療治療LoVo人結(jié)腸癌移植性裸鼠的生存期比化療組有所延長，化療為祛邪，中醫(yī)補(bǔ)益法為扶正，二者結(jié)合，共臻扶正祛邪而達(dá)陰平陽秘之效，延長生存期。劉鐵龍［9］通過研究發(fā)現(xiàn)中藥聯(lián)合化療治療組生存率明顯優(yōu)于單純化療組。延后干預(yù)組和提前干預(yù)組較之同步干預(yù)組有更大的生存獲益趨勢，這可能與其在化療期間，機(jī)體的脾胃功能受到損傷有一定相關(guān)性［10］，使同步干預(yù)組的裸鼠對中藥的吸收有一定影響，進(jìn)而影響中藥協(xié)同化療的生存獲益，延后干預(yù)組較之提前干預(yù)組有更大的生存獲益趨勢。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，補(bǔ)益法的介入以純虛無邪這一時機(jī)為最佳，王素玲等［10］也指出中藥湯劑的切入，以化療間歇期為宜，在一周期化療結(jié)束后即據(jù)情審證求因，予以合理中藥湯劑，脾胃功能恢復(fù)較快，對化療的耐受力增強(qiáng)，為化療的有序開展保駕護(hù)航。而生存期的延長與移植瘤的平均瘤重可能無關(guān)，中醫(yī)中藥協(xié)同化療是通過多種途徑多種靶點(diǎn)起到抗腫瘤作用的，重視帶瘤生存。楊靜［6］發(fā)現(xiàn)，健脾利腸湯能增強(qiáng)體質(zhì)，有可能使宿主和腫瘤處在相對平衡的狀態(tài)，從而達(dá)到長期“帶瘤生存”的治療效果。中醫(yī)補(bǔ)益法協(xié)同化療治療人結(jié)腸癌主要是通過扶正來延長總生存期和改善生存質(zhì)量，并非一味的通過攻伐祛邪來達(dá)到縮小瘤塊的效果。

本實(shí)驗結(jié)果提示，延后干預(yù)組和提前干預(yù)組能協(xié)同5－Fu促進(jìn)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制Bcl－2，引起細(xì)胞凋亡。中醫(yī)補(bǔ)益法延后干預(yù)和提前干預(yù)可能通過提高腫瘤細(xì)胞對5－Fu的敏感性，以提高5－Fu對結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的殺傷性，即能協(xié)同5－Fu促進(jìn)抑凋亡蛋白的降解，促凋亡蛋白的表達(dá)。

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