INF-γ基因轉(zhuǎn)染肺泡巨噬細(xì)胞抗腫瘤活性的研究

周鳳麗 畢筱剛 張?zhí)焱?黃靜

肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)，已經(jīng)成為一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康與生命安全的疾病。目前肺癌的治療療效仍然未取得突破性的進(jìn)展，尋找新的多方面的治療途徑仍然是目前需要解決的問(wèn)題，免疫基因治療就是有待研究的主要治療途徑之一。

肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophage, AM）是肺部防御的首要細(xì)胞，占正常人支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)的80%以上。AM具有多種抗腫瘤功能，能通過(guò)直接融解和吞噬作用，還能分泌多種細(xì)胞因子，如：腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）、一氧化氮（nitric oxide,NO）、白細(xì)胞介素I（interleukin I, IL-1）等，起到抗腫瘤的作用?；罨腁M抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)，干擾素-γ（interferon-γ, INF-γ）是很強(qiáng)的巨噬細(xì)胞活化因子，直接作用于巨噬細(xì)胞即能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬和分泌功能[1]。利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將某些特殊的基因轉(zhuǎn)入巨噬細(xì)胞從而改變巨噬細(xì)胞的免疫功能的研究國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道[2-5]，但多為動(dòng)物（鼠）的腹腔AM的實(shí)驗(yàn)或人AM的非抗腫瘤功能的研究。本文設(shè)計(jì)利用INF-γ體外轉(zhuǎn)入肺癌患者AM，觀察AM抗腫瘤功能的變化，為臨床應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)于肺癌的免疫基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 肺癌患者，共30例，均經(jīng)病理證實(shí)，其中小細(xì)胞肺癌8例，非小細(xì)胞肺癌22例。既往未經(jīng)任何治療。

1.2 AM的收集 按常規(guī)纖維支氣管鏡操作進(jìn)行支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage, BAL），以37oC的滅菌生理鹽水，每次50 mL，注入后立即抽吸，反復(fù)4次，收集灌洗液。以貼壁分離的方法分離和純化AM，臺(tái)盼藍(lán)染色，倒置顯微鏡下鑒定。

1.3 將人INF-γ CDNA構(gòu)建于真核表達(dá)質(zhì)粒，獲表達(dá)人INF-γ基因的真核表達(dá)載體 利用雙酶切定向克隆技術(shù)，將人INF-γ全長(zhǎng)cDNA與表達(dá)質(zhì)粒pREP-8的DNA相連接，構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒Prep-8-INF-γ（由上海銳谷生物科技有限公司完成）。

1.4 將純化的AM與人IFN-γ基因轉(zhuǎn)染液共同孵化 在24孔板上分別加入AM 1×106/孔，INF-γ基因轉(zhuǎn)染液100 μL/孔（設(shè)不表達(dá)INF-γ的質(zhì)粒對(duì)照和磷酸鈣對(duì)照）。置37oC、5%CO2中孵育2 h，洗去轉(zhuǎn)染液。孵育后的AM，加含10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集培養(yǎng)上清液及AM。

1.5 RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染了INF-γ基因的AM總RNA的RTPCR產(chǎn)物

1.6 上清液檢測(cè)

1.6.1 INF-γ的活性測(cè)定 采用ELISA法[6]。

1.6.2 TNF-α含量測(cè)定 采用ELISA法。按北京邦定生物醫(yī)學(xué)公司試劑盒提供的操作程序進(jìn)行，測(cè)波長(zhǎng)570 nm處的OD值。

1.6.3 NO含量測(cè)定 采用Gries法。將亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為320 μmol/L、160 μmol/L、80 μmol/L、40 μmol/L、20 μmol/L、10 μmol/L、和5 μmol/L 7個(gè)濃度，加入96孔板，每份樣品3個(gè)復(fù)孔；將待測(cè)AM培養(yǎng)上清和空白對(duì)照（只加蒸溜水）加入另一行96孔板中，所有樣品均加0.1 mL，均為3個(gè)復(fù)孔；然后各孔加入Gries試劑0.1 mL，室溫顯色10 min后用酶標(biāo)儀上570 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。用計(jì)算和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線即可推算出NO含量。

1.6.4 IL-1含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[7]，樣本作1:5稀釋?zhuān)靼逶O(shè)標(biāo)準(zhǔn)品校正孔，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算各樣本中IL-1含量。

1.7 AM殺傷活性的檢測(cè) 用MTT間接比色法[6]。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L1210細(xì)胞，經(jīng)Hanks’液洗后，用RPMI-1640液完全培養(yǎng)基配成1×106/L備用。取1×107/L的AM加入96孔板中，每孔100 μL，1.5 h后以Hanks’液洗2次，再加入L1210細(xì)胞（100 μL/孔），每一樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔及L1210細(xì)胞對(duì)照。于37oC下24 h后，振蕩懸浮細(xì)胞。每孔取100 μL加入另一96孔板中，各加入5 g/L的MTT 20 μL/孔，培養(yǎng)4 h后，再加入100 g/L的SDS100 μL/孔，6 h-8 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm的OD值。并計(jì)算殺傷活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以Mean±SD表示。組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AM活力測(cè)定 對(duì)貼壁分離的AM用臺(tái)盼籃染色法測(cè)定細(xì)胞活力，其中活細(xì)胞不染色，結(jié)果表明活細(xì)胞率達(dá)95%以上。

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 INF-γ基因只在轉(zhuǎn)染了Prep-8-INF-γ的AM內(nèi)轉(zhuǎn)錄，在相當(dāng)于350 bp處有一清晰的條帶，而在未轉(zhuǎn)染Prep-8-INF-γ肺癌患者的AM內(nèi)無(wú)轉(zhuǎn)錄（無(wú)相應(yīng)的條帶），磷酸鈣對(duì)照亦無(wú)相應(yīng)的條帶出現(xiàn)（圖1）。

2.3 INF-γ基因轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中INF-γ活性的檢測(cè)結(jié)果 INF-γ基因轉(zhuǎn)染AM培養(yǎng)上清液中4 h即能檢測(cè)到INF-γ，7 d后檢測(cè)到INF-γ的水平為（34.5±3.2）ng/mL；而不表達(dá)INF-γ的質(zhì)粒對(duì)照組檢測(cè)到的INF-γ平均值為（5.5±1.6）ng/mL。基因轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組比較INF-γ水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.739, P＜0.001）。

2.4 INF-γ基因轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、NO和IL-1水平的檢測(cè)結(jié)果 INF-γ基因轉(zhuǎn)染后AM培養(yǎng)上清液中TNF-α水平明顯高于質(zhì)粒對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；INF-γ基因轉(zhuǎn)染后AM培養(yǎng)上清液中NO水平明顯高于質(zhì)粒對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；INF-γ基因轉(zhuǎn)染后AM培養(yǎng)上清液中IL-1水平明顯高于質(zhì)粒對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（表1）。

2.5 INF-γ基因轉(zhuǎn)染后AM對(duì)L1210細(xì)胞的殺傷活性的檢測(cè)結(jié)果 INF-γ基因轉(zhuǎn)染后AM對(duì)L1210細(xì)胞的殺傷率為（68.9±5.9）%，而質(zhì)粒對(duì)照組對(duì)L1210細(xì)胞的殺傷率為（15.5±2.1）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=72.482, P＜0.001）。

表1 基因轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組AM培養(yǎng)上清液中TNF-α、NO和IL-1水平（Mean±SD）Tab 1 The content of TNF-α, NO and IL-1 in incubating solution of alveolar macrophages of two groups (Mean±SD)

圖1 RT-PCR檢測(cè)AM內(nèi)INF-γ基因轉(zhuǎn)錄條帶圖。M：marker；1：未轉(zhuǎn)染INF-γ基因的肺泡巨噬細(xì)胞中總RNA的RT-PCR產(chǎn)物；2：轉(zhuǎn)染了INF-γ基因的AM總RNA的RT-PCR產(chǎn)物；3：磷酸鈣對(duì)照。Figure 1 the figure of INF-γ gene transcription of AMs with RT-PCR.M：marker；1: the RT-PCR product of total RNA in AMs that INF-γ gene were not transfected into; 2: the RT-PCR product of total RNA in AMs that INF-γ gene were transfected into; 3: the control of calcium phosphate.

3 討論

巨噬細(xì)胞具有免疫功能，國(guó)內(nèi)外的研究[2-5]顯示，利用體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)可以改變巨噬細(xì)胞的免疫活性?？鼓[瘤免疫功能是巨噬細(xì)胞的重要免疫功能之一，巨噬細(xì)胞也是主要的腫瘤免疫細(xì)胞，而肺組織中大量的AM起著重要的抗肺癌的免疫功能，巨噬細(xì)胞的活化是其抗腫瘤功能的基礎(chǔ)，能否通過(guò)體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將巨噬細(xì)胞活化因子INF-γ基因轉(zhuǎn)入AM，從而使AM活化，使其抗肺癌活性增強(qiáng)，是本研究的目的。

巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子是其抗腫瘤活性的主要途徑，TNF-α、NO、IL-1是AM分泌的具有抗腫瘤效應(yīng)的主要細(xì)胞因子，TNF-α可引起腫瘤細(xì)胞壞死和導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[8-10]；IL-1可通過(guò)激活細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞起到殺腫瘤細(xì)胞的作用；NO可阻斷腫瘤細(xì)胞的能量代謝和DNA復(fù)制而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[11]。本研究結(jié)果顯示，肺癌患者的AM經(jīng)體外轉(zhuǎn)染人INF-γ基因后，其培養(yǎng)上清液中TNF-α、NO、IL-1的含量均較對(duì)照組明顯增高（均為P＜0.001），提示人INF-γ基因轉(zhuǎn)染后，肺癌患者AM產(chǎn)生以上3種細(xì)胞因子的活性明顯增強(qiáng)，提示其抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)。

巨噬細(xì)胞還可通過(guò)吞噬作用和依賴(lài)跨膜型腫瘤壞死因子的接觸溶解起殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株L1210細(xì)胞被廣泛用于巨噬細(xì)胞殺瘤活性的檢測(cè)[12,13]，本研究檢測(cè)AM殺傷L1210細(xì)胞的活性結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了人INF-γ基因的肺癌患者AM殺傷L1210細(xì)胞的能力較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，直接說(shuō)明肺癌患者AM抗腫瘤活性在轉(zhuǎn)染了人INF-γ基因后明顯增強(qiáng)。

激活的巨噬細(xì)胞才能具有分泌功能和殺傷活性。INF-γ是巨噬細(xì)胞激活劑中作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一，INF-γ直接與AM培養(yǎng)都能激活A(yù)M使之抗腫瘤活性增強(qiáng)[1]。我們采用體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將人INF-γ基因轉(zhuǎn)入肺癌患者AM，RT-PCR顯示INF-γ基因只在轉(zhuǎn)染了Prep-8-INF-γ的AM內(nèi)轉(zhuǎn)錄，同時(shí)檢測(cè)到AM培養(yǎng)上清液中INF-γ的高濃度表達(dá)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染是成功的；同時(shí)檢測(cè)到轉(zhuǎn)染了人INF-γ基因的AM培養(yǎng)上清液中TNF-α、NO、IL-1三種細(xì)胞因子均較對(duì)照組明顯升高（均為P＜0.001），且其殺傷L1210細(xì)胞活性亦明顯較對(duì)照組增強(qiáng)（P＜0.001），提示AM已明顯被激活，具有抑瘤和殺瘤的作用。

本研究采用的體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將人INF-γ基因轉(zhuǎn)入肺癌患者AM，使其抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)，為將來(lái)臨床應(yīng)用體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)增強(qiáng)AM抗肺癌作用的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。