肺癌早期診斷研究進展

劉一臻 綜述 王明榮 審校

肺癌是當今世界各國最常見的惡性腫瘤，其死亡率居于各種腫瘤的首位，對人類健康和生命構(gòu)成極大威脅。在我國，肺癌每年約致40萬例患者死亡[1]。然而，研究顯示I期肺癌術(shù)后10年生存率可達到92%[2]。因此，降低肺癌患者死亡率的關(guān)鍵在于早期診斷和早期治療。

關(guān)于早期肺癌的概念在國際上依然存在著不同的觀點，有學(xué)者認為原位癌和Ia期肺癌為早期肺癌[3]，也有認為早期肺癌是指全部I期肺癌[4]，還有學(xué)者認為I期和II期都屬于早期[5]，另有認為直徑＜3 cm即為早期肺癌[6]。隨著肺癌病因?qū)W、分子標志物研究工作的進展，以及低劑量螺旋CT、熒光纖維支氣管鏡和液基細胞學(xué)在臨床的應(yīng)用，肺癌的早期診斷取得了長足的進步，本文擬就該領(lǐng)域的研究進展作一綜述。

1 肺癌早期診斷方法

1.1 影像學(xué)檢查 胸部X光片優(yōu)點是能觀察胸部各種結(jié)構(gòu)的全貌，經(jīng)濟且方便。但因其分辨率低、組織結(jié)構(gòu)互相重疊，在肺癌早期診斷方面并不具優(yōu)勢，更精確的數(shù)字化成像可能是未來的發(fā)展方向之一[7]。低劑量螺旋CT（low-dose CT, LDCT）優(yōu)點是可以檢測到2 mm-3 mm的小結(jié)節(jié)，盡管有報道LDCT篩查不能明顯提高生存率[8]，但在全美范圍內(nèi)進行的大型隨機肺癌篩查（National Lung Screening Trial, NLST）研究的初步結(jié)果顯示，其可降低肺癌死亡率達20%[9]。鑒于現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)不一致，2010年肺癌NCCN指南暫不推薦在非小細胞肺癌臨床實踐中常規(guī)進行CT篩查。PET雖在肺癌早期診斷應(yīng)用方面并無定論，但其已成為輔助肺癌分期的重要手段，采用PET/CT對早期患者進行準確分期，可以避免不恰當?shù)氖中g(shù)[10]。

1.2 支氣管內(nèi)鏡 各種支氣管內(nèi)鏡的發(fā)展使得其在肺癌早期診斷中發(fā)揮越來越重要的作用。自發(fā)熒光支氣管鏡（autofluorecence bronchoscopy, AFB）較之常規(guī)白光支氣管鏡（white-light bronchoscop, WLB）不僅可提高早期癌變的檢出率，也可更清晰地顯示腫瘤的輪廓。一項在大于1,000例的比較研究[11]中顯示，單用WLB可檢測到40%的侵襲前病例，而聯(lián)用AFB可將檢出率提高到80%。但AFB對于侵襲前病變診斷特異性較低，自發(fā)熒光成像電子支氣管鏡系統(tǒng)（auto-fluorescence imaging, AFI）可通過檢測區(qū)域的顏色區(qū)分癌前病變和支氣管的良性改變，從而解決了這一難題。此外，窄帶成像支氣管鏡（narrow band imaging, NBI）可對支氣管粘膜及血管進行清晰顯示，故在鱗癌的癌前病變診斷方面具有很大優(yōu)勢。將自發(fā)熒光和窄帶成像統(tǒng)一結(jié)合于電子支氣管鏡成像系統(tǒng)上可能是未來的發(fā)展方向，其可減少臨床操作時間，同時可避免一些不必要的活檢操作[12]。

2 肺癌分子標志物

肺癌的發(fā)生是多因素致病、多基因參與和多階段發(fā)展的復(fù)雜過程，鑒于以上種種檢查手段的敏感性、特異性、適用度等方面的局限，近年來國內(nèi)外學(xué)者對有關(guān)肺癌早期診斷的分子標志物做了大量有益的探索。

2.1 染色體水平 等位基因丟失或雜合性丟失在肺癌早期常被探測到，如3p14、9p21、17p13、13q14、5q21、1q、2q和8q，它們也可在吸煙者或既往吸煙者的組織學(xué)正?；蛟錾掀ぶ刑綔y到。最常發(fā)生異常改變的是3p[13,14]，這也是諸多抑癌基因（tumor suppressor gene, TSG）所在的染色體區(qū)段。最近一項在痰液中檢測染色體非整倍性的病例對照研究[15]顯示，一組FISH探針（EGFR、MYCC、5p15及CEP6）聯(lián)合痰細胞學(xué)，可提前于常規(guī)診斷18個月預(yù)測肺癌發(fā)生，診斷敏感度和特異性分別為76%和88%。

2.2 DNA水平 腫瘤是一種由多個關(guān)鍵基因的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變導(dǎo)致的轉(zhuǎn)化細胞克隆增殖的疾病，關(guān)鍵基因的改變可以是胚系突變或體細胞突變。

華盛頓大學(xué)基因研究所在188例肺腺癌中對623個與肺癌發(fā)生有已知或潛在關(guān)系的基因進行測序，發(fā)現(xiàn)了多于1,000個體細胞突變，最終確定了26個最常見的突變，涉及TP53、KRAS、STK11、EGFR、LRP1B等基因[16]。對這些基因進行大樣本的臨床驗證，可能發(fā)現(xiàn)有助于早期診斷的標志物。

Belinsky等[17]發(fā)現(xiàn)一組基因的甲基化在診斷肺癌方面具有較高的敏感度和特異性。他們收取了3,259例患者的痰液，其中182例被診斷為肺癌，具有高質(zhì)量DNA的病例有98例，非癌組92例作為對照。共檢測了14個基因的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)6個（P16、MGMT、DAPK、RASSFIA、PAX5β及GATA5）與肺癌發(fā)生風(fēng)險增高相關(guān)，其中3個或更多個基因的共同甲基化可增加6.5倍肺癌發(fā)生的風(fēng)險，對肺癌檢出的敏感性和特異性均為64%。研究者認為此敏感性還不足以在大規(guī)模人群中開展前瞻性研究，有待對候選基因進行更多的驗證。

Spira等[18]檢測了129例接受了支氣管鏡刷檢的吸煙者的支氣管上皮細胞，并一直隨訪到檢查者最終獲得活檢/手術(shù)病理結(jié)果，有60例被診斷為肺癌，69例無肺癌。研究者用其中77例作為實驗組通過表達譜芯片得到一組含80個基因的標志物，并在其余52例樣本中進行驗證，發(fā)現(xiàn)其診斷敏感度和特異性分別為80%和84%。在92例支氣管鏡未確診患者中，診斷敏感度和特異性分別為89%和83%。將標志物與支氣管鏡合用，診斷敏感性和陰性預(yù)測率均高達95%，尤其對于I期肺癌，標志物診斷的敏感性為90%，而常規(guī)支氣管鏡的敏感性為35%。通過此項研究，Spira等認為在細胞學(xué)正常的支氣管上皮標本中的基因表達也可作為肺癌的診斷標志物。

關(guān)于循環(huán)腫瘤細胞DNA的研究[19,20]也有很多，但由于缺乏統(tǒng)一標準、各項研究所采用的界值不一致、可重復(fù)性較差等問題，迄今還沒有實現(xiàn)臨床應(yīng)用。

2.3 蛋白水平

2.3.1 血清蛋白改變 血清蛋白標志物檢測具有高效、高靈敏性、性價比高、方便簡捷、快速、標本易獲取及創(chuàng)傷小的特點。目前在肺癌中研究的血清腫瘤相關(guān)抗原標志物有CEA、NSE、TPA、Chromogranine、CA125、CA19-9、Cyfra21-1，敏感性和特異性在50%-90%不等，大部分標志物隨病變進展陽性檢出率增高。

Garaci等[21]在534例個體的外周血中對TLP進行檢測，發(fā)現(xiàn)其在非小細胞肺癌患者中的檢出率為53.1%，而在其它類型腫瘤患者中未檢測到。在I期肺癌中有75%可檢測到TLP。Tarro等[22]總結(jié)文獻報道的肺癌血清標志物研究的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，作為I期肺癌診斷標志物，TLP的檢出敏感性和特異性分別為66.7%和80%，而其它常見血清標志物CA19-9為33.3%和100%，Cyfra21-1為11.1%和100%，CA125為11.1和100%，CEA為0和100%。

Yang等[23]用質(zhì)譜技術(shù)檢測了158例肺癌患者和50例對照的血清，其中47例肺癌患者血清與20例正常對照作為實驗組，發(fā)現(xiàn)5個標志峰，然后在84例肺癌患者和30例正常對照中進行盲性驗證，發(fā)現(xiàn)檢測敏感性為87%，特異性為80%。

Nisman等[24]檢測了37例肺部良性病變、88例非小細胞肺癌和37例小細胞肺癌患者血清中ProGRP、NSE、CYFRA21-1及CEA的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ProGRP在區(qū)分小細胞肺癌和肺部良性病變及非小細胞肺癌方面優(yōu)于NSE，特異性可達90%以上，ProGRP對于小細胞肺癌的檢出敏感性為95%，可能作為小細胞肺癌診斷的一個候選標志物。

腫瘤相關(guān)自身抗體的檢測近年也有很大發(fā)展，一項在125例非小細胞肺癌患者和125例性別、年齡、吸煙狀態(tài)等因素匹配的正常對照中的研究顯示，CFH自身抗體可在51.5%的早期肺癌中檢測到，而在對照組中僅有8.0%[25]。另有研究顯示，一組由6個自身抗體構(gòu)成的血清蛋白標志在高危人群中診斷肺癌的敏感性和特異性可分別達94.8%和91.1%[26]。

2.3.2 組織蛋白（標志）變化 在支氣管活檢標本中，p53的過表達是一個很有趣的標志物，在化生中是不存在的，但在不典型增生中的存在程度與癌的形成密切相關(guān)。一項調(diào)查[27]結(jié)果顯示，p53表達陽性率在輕度不典型增生病變中為19%，中度不典型增生為36%，原位癌為59%。一項在378例肺癌手術(shù)標本中的免疫組化結(jié)果[28]顯示，UHRF1在幾乎一半的肺癌早期病例中均有表達，UHRF1特異表達于癌細胞的細胞核，而在手術(shù)切端組織、間質(zhì)細胞及炎性細胞中均不表達，可能作為肺癌早診的潛在蛋白標志。

近些年，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展以及蛋白芯片的應(yīng)用使得越來越多的標志物被發(fā)現(xiàn)，但還需在組織樣本與大規(guī)模人群中驗證。

2.4 RNA水平 Sueoka等[29]用Real-time RT-PCR的方法檢測了44例肺癌患者、7例肺部增生病變患者、24例肺部良性病變患者及25例正常對照的血漿hnRNPB1水平，發(fā)現(xiàn)在肺癌患者中顯著高于正常對照及肺部良性病變者（P＜0.05）尤其在鱗癌患者中顯著高于腺癌患者水平。他們認為其可作為一種無創(chuàng)篩查用于肺癌的早期診斷。Yu等[30]在痰液中研究發(fā)現(xiàn)一組miRNAs標志（miR-21、miR-486、miR-375和miR-200b）可將肺腺癌患者和正常人群很好的區(qū)分開，敏感性和特異性分別達80.6%和91.7%。

還有很多其它mRNA表達譜的研究報道，但缺乏敏感性和特異性數(shù)據(jù)。

2.5 呼出氣體 呼出氣體是比痰液更易得的標本，在這種樣本中尋找肺癌標志物是一項新的有益探索。文獻[31,32]報道，呼出氣體中一組由VOCs構(gòu)成的標志物可區(qū)分肺癌患者與正常受檢者。隨著檢測技術(shù)如TOF MS、PTRMS、SIFT-MS和激光光譜等的不斷發(fā)展，對呼出氣體及呼出氣冷凝液中肺癌標志物的研究逐漸深入，但該領(lǐng)域總體仍處于較初級階段。輕便的檢測裝置、低廉的檢測價格以及結(jié)果的易于判讀，將會是此方面檢測今后應(yīng)用于臨床的重要發(fā)展方向[33]。

3 高危人群易感相關(guān)基因

迄今為止，在肺癌中研究者還沒有找到一種像APC與家族性結(jié)腸息肉病那樣關(guān)系密切的胚系突變。研究[34,35]認為，遺傳有可能獨立于吸煙史或環(huán)境中煙草暴露劑量而成為發(fā)生肺癌的因素。Bailey-Wilson等[36]報道6q23-q25可能存在肺癌易感基因。

流行病學(xué)研究表明，肺癌易感風(fēng)險增高與一些遺傳性癌癥綜合征有關(guān)，而這往往與p53[37]、EGFR[38]等基因的胚系突變有關(guān)。大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)性研究[39,40]發(fā)現(xiàn)15q24-15q25.1區(qū)域的SNP與肺癌發(fā)生有關(guān)，其中包含兩個受尼古丁暴露劑量調(diào)控編碼煙堿乙酰膽堿受體alpha亞基的基因。另有研究[41]顯示，位于5p15.33的rs2736100與非吸煙女性患肺腺癌風(fēng)險顯著相關(guān)。

Wu等[42]在中國人群中發(fā)現(xiàn)與肺癌易感風(fēng)險有顯著相關(guān)的四個SNP位點，即rs2036534C＞T、rs667282C＞T、rs12910984G＞A和rs6495309T＞C，其均位于15q25。該研究組還發(fā)現(xiàn)與肺癌發(fā)生風(fēng)險增高顯著相關(guān)的其它一些位點，如：XRCC1 5'UTR區(qū)的SNP-77T＞C[43]，ERCC1 5’側(cè)翼區(qū)的-433T＞C和262G＞T[44]，F(xiàn)EN1啟動子區(qū)的rs174538G＞A和rs4246215G＞T[45]，MAD1L1和MAD2L1的遺傳性變異[46]和CASP8啟動子區(qū)6個核苷酸的缺失多態(tài)[47]。

表1綜合了近兩年肺癌全基因組關(guān)聯(lián)研究（genomewide association study, GWAS）的部分結(jié)果。GWAS可同時檢測基因組中成百上千的變異，從而發(fā)現(xiàn)疾病的候選基因，為人們研究腫瘤易感基因提供了新的方式，對了解腫瘤的發(fā)病機制提供了更多的線索。通過GWAS盡管已發(fā)現(xiàn)大量與肺癌相關(guān)的變異，但仍然僅占整個基因組變異中的一小部分，所起的作用也非常小。而且在這種情況下，很小的一點系統(tǒng)或隨機誤差都可能導(dǎo)致不正確的結(jié)果，故而在GWAS中基因數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制非常重要[53]。再者，正因為GWAS僅關(guān)注于每種腫瘤基因組構(gòu)成中的一小部分基因變異,低估了腫瘤自然發(fā)生的復(fù)雜性。因此，對GWAS取得的發(fā)現(xiàn)仍需要大量長期的隨訪方可定論，以闡明關(guān)聯(lián)之下的分子生物學(xué)機制，進而評價肺癌的發(fā)生風(fēng)險及疾病轉(zhuǎn)歸。

表1 肺癌的全基因組關(guān)聯(lián)研究Tab 1 Genome-wide association study of lung cancer

4 問題與展望

肺癌已成為世界癌癥死亡的首要原因，人們一直在不斷探索肺癌早期診斷的新技術(shù)，包括在血清、痰液、呼出氣體及支氣管活檢中尋找用于肺癌早期診斷的標志物，甚至口腔上皮也被用于肺癌檢測[54]，所發(fā)現(xiàn)的大量標志物均需經(jīng)過多中心大樣本的驗證。多個標志物的聯(lián)合應(yīng)用將會是未來標志物檢測的重要發(fā)展方向之一。此外，基因工程小鼠模型在肺癌早期診斷研究中得到越來越多的關(guān)注，有可能成為今后研究方向之一，多光子顯微成像等多種影像技術(shù)的發(fā)展也使得小鼠模型在肺癌早期診斷中發(fā)揮越來越重要的作用[55]。

另一方面，在臨床中檢測特異標志物的儀器設(shè)備需要進一步發(fā)展。原位癌一般包括4層-38層細胞、且大多數(shù)病損有5層細胞的厚度，由非周圍型支氣管粘膜的異型細胞斑塊構(gòu)成，一般只有幾個毫米[56,57]，更何況潛在癌變的細胞克隆遠遠小于現(xiàn)今測量技術(shù)可達的最小閾值，這就可以解釋為什么常規(guī)手段如胸片、CT和纖維支氣管鏡在早期診斷方面不那么有效了。需要開發(fā)出更準確更敏感的技術(shù)，以期對肺癌進行早期診斷。再者，對腫瘤早期的標志物進行動態(tài)測定和與影像學(xué)方法相結(jié)合的分子影像技術(shù)的發(fā)展，將可能為肺癌的早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷帶來新的希望。有理由相信，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，21世紀人類對肺癌早診早治的工作會有更大的作為，將取得更大的成就。