川烏炮制品減毒增效的實(shí)驗(yàn)研究

吳剛剛 ,章小菁,梁澤華

(浙江中醫(yī)藥大學(xué),浙江 杭州 100053)

1 引言

川烏為毛茛科植物,烏頭的干燥母根,其性味辛 、苦 、熱 、有大毒,歸心 、肝 、腎 、脾經(jīng) 。 臨床用其炮制品,功能為祛風(fēng)除濕,溫經(jīng)止痛主要治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,大骨節(jié)痛,半身不遂,偏頭痛,坐骨神經(jīng)痛,虛寒性疝氣和跌打腫痛等[1]。但在治療過(guò)程中往往因服藥過(guò)量,導(dǎo)致中毒,臨床也常見(jiàn)中毒甚至死亡的事件。川烏主含多種生物堿,其中脂型生物堿毒性最大,主要毒性表現(xiàn)為胸悶,心悸,血壓下降(甚至測(cè)不出)和各種心律失常,并可導(dǎo)致休克,甚至死亡。本課題組為分析探索出川烏炮制的科學(xué)方法,特以毒性中藥川烏為基礎(chǔ),通過(guò)正確的高效液相和細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)分析方法,驗(yàn)證川烏及其炮制品的毒性,可以為臨床診斷烏頭堿中毒,搶救烏頭堿中毒提供依據(jù),也為毒理學(xué)研究川烏毒性提供參考[2]。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM小鼠(18～22)g,雌雄各半,浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(衛(wèi)生使用許可證:SYXKC(浙)2008-0115,動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(浙)2007-0005)。

2.2 設(shè)備

SPS 2001F型電子天平(梅特勒-托利多(常州)稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司);DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);SHB-ⅢA型循環(huán)水式真空泵(河南省太康科教器材廠);RE52-98型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DGG-9140B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);TD25-WS型自動(dòng)平衡離心機(jī)(賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

2.3 藥品和試劑

生川烏由長(zhǎng)河同春堂藥店提供,經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)黃真教授鑒定為毛茛科植物烏頭(Aconitum carm ichaeli Debx)的干燥母根。甲醛(分析純)(批號(hào):20080604,衢州巨化試劑有限公司);無(wú)水乙醇(分析純)(批號(hào):0806073601,安徽安特生物化學(xué)有限公司);二甲苯(分析純)(批號(hào):20080601,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);碘酸鈉(批號(hào):20080415,上海銳聰科技發(fā)展有限公司)。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法及原理

2.4.1 川烏炮制品炮制

(1)未炮制品(即生川烏)。直接取川烏洗凈,晾曬,切片,干燥,粉碎備用。

(2)米醋法炮制。生川烏洗凈,用水浸泡48h,每隔12h換1次水,取出。先將生姜加定量水煮開(kāi)10min,取汁,然后加米醋,生姜汁(川烏每 50kg,米醋1.25kg,生姜1.25kg)與浸泡后的川烏分別加水共煮90min,取出,晾曬至 6成干,切片,粉碎,備用[3]。

(3)藥典法炮制。生川烏洗凈,浸泡10～48h,至內(nèi)無(wú)干心,取出,加沸水煮 4～6h,切開(kāi)無(wú)白心,口嘗微有麻舌感,取出,切片,粉碎備用[4]。

(4)黑豆法炮制。生川烏洗凈,用水浸泡12h,取出,加黑豆,甘草,生姜(川烏每100kg,用甘草5kg,黑豆 10kg,生姜 10kg),加水煮 2h,取出,除去黑豆,甘草,生姜,晾曬至6成干,切片,干燥,粉碎備用[3]。

2.4.2 烏頭堿提取

川烏粉加水煎煮2～3次,濾液濃縮至 1∶1～1∶2(mL:g),加適量醇,濃度約為 63%,在25℃下靜置(10～48h),濾過(guò);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇,得烏頭堿浸膏。浸膏中生藥含量,未炮制組為2.8g/g,醋制組為10.4g/g,藥典法為2g/mL。烏頭堿能溶于水,醇含量50%～60%時(shí)淀粉,多糖沉淀[6]。半數(shù)致死量(LD50)是藥物、毒物及病原微生物等毒力水平的一個(gè)標(biāo)志。它表示能使全部實(shí)驗(yàn)對(duì)象死亡半數(shù)的劑量或濃度。由于生物間存在個(gè)體差異性,因此LD50需用一批相當(dāng)數(shù)量的實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方能測(cè)得,并且每種藥物不同實(shí)驗(yàn)對(duì)象的LD50值不相同。測(cè)定LD50的方法很多,如目測(cè)機(jī)率單位法、直線回歸法、累計(jì)法及序貫法等。由于寇氏法較常用,并有計(jì)算簡(jiǎn)便,結(jié)果較準(zhǔn)確等特點(diǎn),故采用該方法進(jìn)行計(jì)算。當(dāng)最小劑量組的死亡率為0%,最大劑量組的死亡率為100%時(shí),可按下列公式計(jì)算[7]LD50:

當(dāng)最小劑量組的死亡率大于0%而又小于30%,或最大劑量組的死亡率小于100%而又大于70%時(shí),可按下列校正公式計(jì)算LD50:

其中SX50為L(zhǎng)D50的標(biāo)準(zhǔn)誤,Xm為最大劑量組劑量的對(duì)數(shù)值;i為相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)之差;Σ p為各組死亡率之和;P為各組死亡率;q為各組存活率;n為各組動(dòng)物只數(shù);Pm為最大劑量組死亡率;Pn為最小劑量組死亡率。

2.5 毒性實(shí)驗(yàn)分析

2.5.1 預(yù)試

取昆明小鼠80只,雌雄各半,體重 20±2g,隨機(jī)分組10組,每組8只。未炮制品和醋制法炮制品分別選擇組距較大的一系列劑量,按組1g/kg樣品溶液給小鼠灌胃,觀察出現(xiàn)的癥狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用頸椎脫臼法處死小鼠。

2.5.2 LD50的測(cè)定

昆明小鼠80只,雌雄各半,體重 20±2g,隨機(jī)分10組,每組8只。根據(jù)預(yù)試結(jié)果,生川烏最高劑量組定為9g/kg,最低劑量組定為3g/kg,劑間比為0.76。醋制法炮制品最高劑量組定為118g/kg,最低劑量組定為36g/kg,劑間比為0.74。將樣品用蒸餾水配置成所需濃度,以0.2mL/10g小鼠體重給以灌胃。觀察統(tǒng)計(jì)死亡率,用改良寇式法計(jì)算其LD50及其95%可信限。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 川烏各炮制品的LD50及95%可信限

從表 1可看出生川烏毒性很強(qiáng),其 LD50為5.36g/kg,相比其他炮制品的LD50數(shù)據(jù)可以明顯看出,生川烏的致死劑量極低,而川烏經(jīng)炮制后,毒性明顯較生川烏低。出現(xiàn)中毒癥狀的劑量大大升高,中毒癥狀也較為減弱。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以得出黑豆法炮制后,毒性降低最為明顯,其次是醋制法和藥典法。

2.6 烏頭堿藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.6.1 熱板法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

昆明小鼠50只,體重 20±2g,均為雌性,給藥前禁食16h,選取痛閾在10～30s內(nèi)的小鼠,隨機(jī)分五組,分別為生理鹽水對(duì)照組、生川烏組、醋制組、藥典組、黑豆組,每組10只。每只小鼠按0.1mL/10g(生藥0.52g/kg,LD50的1/10)分別給藥,空白組給予等體積的生理鹽水,藥液濃度為0.052g/mL。以生理鹽水為空白對(duì)照組,測(cè)定給藥后 30、60、90、120min的痛閾值。實(shí)驗(yàn)劑量和結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 熱板法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=10)

川烏四種不同炮制品對(duì)大鼠都具有鎮(zhèn)痛作用,與空白組相比均有極顯著差異,藥典法鎮(zhèn)痛效果在一定時(shí)間范圍內(nèi)逐漸增強(qiáng),以90～120min最明顯,醋制法的鎮(zhèn)痛效果在一定時(shí)間范圍內(nèi)逐漸減弱,以30～60min最明顯。黑豆法在30min時(shí)鎮(zhèn)痛效果較佳,隨著時(shí)間延長(zhǎng)略有減弱。前60min的鎮(zhèn)痛效果生川烏＞醋制法＞黑豆法＞藥典法,90min～120min的鎮(zhèn)痛效果是生川烏＞藥典法＞醋制法＞黑豆法。黑豆法在前60min時(shí)與醋制法相當(dāng)。

2.6.2 醋酸扭體實(shí)驗(yàn)

昆明小鼠50只,雌雄各半,體重 20±2g,給藥前禁食16h,隨機(jī)分5組,分別為生理鹽水對(duì)照組、生川烏組、醋制組、藥典組、黑豆組,每組10只。每只小鼠按0.1mL/10g-1(生藥0.52g/kg-1,LD50的1/10)分別給藥,空白組給予等體積的生理鹽水。以生理鹽水為空白對(duì)照組,每只小鼠給6%醋酸0.2mL,給藥1h,記錄15min內(nèi)扭體次數(shù),并計(jì)算不同炮制品對(duì)扭體反應(yīng)抑制率,實(shí)驗(yàn)劑量及結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表3 小鼠醋酸扭體法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=10)

川烏四組不同炮制品對(duì)大鼠均具有鎮(zhèn)痛作用,其中醋制法、黑豆法與生理鹽水組有顯著差異,在15min內(nèi)扭體(腹部收縮內(nèi)凹,后肢伸展,臀部抬高,蠕動(dòng))次數(shù)明顯減少。其中黑豆法的鎮(zhèn)痛效果最為明顯,鎮(zhèn)痛強(qiáng)度為黑豆法＞醋制法＞藥典法＞生川烏。

2.6.3 耳腫脹抗炎實(shí)驗(yàn)

昆明小鼠50只,雌雄各半,體重 20±2g,給藥前禁食16h,隨機(jī)分5組,分別為生理鹽水對(duì)照組、生川烏組、醋制組、藥典組、黑豆組,每組10只。每只小鼠按0.1mL/10g(生藥0.52g/kg,LD50的 1/10)分別給藥,生理鹽水組給予等體積的生理鹽水,以生理鹽水為空白對(duì)照組,1h后于小鼠右耳兩面涂0.3mol二甲苯致腫,左側(cè)耳朵為對(duì)照,1h后處死,用6mm的打孔器沖下左右耳朵相同的部位,在分析天平上稱重,以左右耳片重量差表示腫脹程度,記錄。實(shí)驗(yàn)劑量及結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表4 抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=10)

四種川烏不同炮制品對(duì)大鼠均具有抗炎作用,與生理鹽水組比較有顯著差異。其中黑豆法的抗炎作用最為明顯,其次是藥典法,醋制法和生川烏的抗炎作用比較接近,相對(duì)較弱?？寡鬃饔脧?qiáng)度為黑豆法＞藥典法＞生川烏＞醋制法。

3 結(jié)語(yǔ)

以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,我們可以通過(guò)改變川烏炮制工藝從而達(dá)到控制川烏炮制品的藥效的目的。川烏不同工藝的炮制品對(duì)小鼠熱板試驗(yàn)具有鎮(zhèn)痛作用,生川烏的毒性最為明顯,藥典法以90～120min最明顯,醋制法以 30～60min最明顯,黑豆法在30min時(shí)鎮(zhèn)痛效果較佳,隨著時(shí)間延長(zhǎng)略有減弱。川烏四組不同炮制品對(duì)小鼠醋酸扭體的鎮(zhèn)痛效果以黑豆法最佳,其次是醋制法,再其次是藥典法,作用最弱的是生川烏。

通過(guò)本次毒性及藥效實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),川烏的各種炮制品均能明顯抑制二甲苯所制小鼠耳廓腫脹,與生理鹽水組相比有著顯著的差異;醋酸扭體實(shí)驗(yàn)顯示川烏不同炮制品能顯著減少醋酸所致小鼠扭體次數(shù),延長(zhǎng)小鼠扭體潛伏期;熱板鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)顯示川烏不同炮制品均能延長(zhǎng)熱板刺激小鼠添足潛伏期,提高熱板小鼠痛閥值。綜合上述試驗(yàn),川烏抗炎鎮(zhèn)痛功效與煎煮時(shí)間、添加輔料、給藥劑量等具有顯著相關(guān)性。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們初步認(rèn)為選擇不同炮制輔料、不同浸泡時(shí)間、不同炮制時(shí)間、不同給藥劑量均對(duì)川烏的藥效產(chǎn)生不同影響,為繼續(xù)深入研究其工藝條件與藥效的關(guān)系,尋找最佳炮制方式,以及合理利用中藥材資源提供了科學(xué)根據(jù)。

川烏作為一種傳統(tǒng)毒性中藥,常被用于臨床用藥。本實(shí)驗(yàn)采用川烏的炮制品通過(guò)灌胃研究不同濃度以及不同炮制品對(duì)大鼠肝細(xì)胞的毒性來(lái)探索出一條切實(shí)可行的加工處理方法,提高藥材的質(zhì)量,保證臨床用藥的安全有效,并且通過(guò)細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)分析方法,驗(yàn)證不同的炮制品的毒性為選擇最佳炮制品提供科學(xué)依據(jù)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,川烏大毒,少量即可起中毒反應(yīng),3～4g即可致死,對(duì)心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞都有較大損傷。川烏經(jīng)炮制后毒性明顯降低,小鼠毒性反應(yīng)強(qiáng)度減弱,以及毒性反應(yīng)的時(shí)間延長(zhǎng)。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們可以通過(guò)改變炮制工藝使得川烏毒性大大降低的同時(shí)使其藥效達(dá)到最佳,便于醫(yī)生的合理用藥及病人的安全用藥。

[1]國(guó)家食品藥品質(zhì)量監(jiān)督管理局.中華人民共和國(guó)國(guó)藥典[R].北京:國(guó)家食品藥品質(zhì)量監(jiān)督管理局,2000.

[2]孟瓊?cè)A,彭 成.烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞毒性作用機(jī)制研究[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué),2004.

[3]Xu C J.Science of p rocessing Chinesemedicnal herbs(中藥炮制學(xué))[M].Shanghai:Shanghai Science Press,1985.

[4]鄭 平,楊煜榮.烏頭堿鎮(zhèn)痛作用部位及其與中樞去甲腎上腺素能系統(tǒng)的關(guān)系[J].中國(guó)藥理學(xué)報(bào),1988,9(6):485.

[5]甄 攀,楊鳳珍.吳茱萸總生物堿提取條件的考察[J].中國(guó)中藥雜志,2000,25(8):50～54.

[6]陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1996.