不同劑量致敏原對幼年大鼠哮喘的影響

劉佩意，蔣卓勤，陳 相，冷 亮，馬立麗

（中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 營養(yǎng)學(xué)系，廣東 廣州 510080）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是由多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)引起的氣道慢性炎癥性疾病。哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明確。而哮喘高發(fā)于兒童，并且近年來兒童哮喘的發(fā)病率在逐年升高。隨著對兒童哮喘關(guān)注的增加，幼年大鼠哮喘模型的研究也引起了學(xué)者的重視。雖然國內(nèi)外哮喘大鼠模型的研究也很多，多使用SD和Wistar大鼠模型[1-2]，但幼年大鼠的哮喘模型卻相對較少。故本實驗綜合了目前國內(nèi)外比較常用的幾種造模方法進(jìn)行了實驗和對比[3-4]，用不同劑量的卵清蛋白誘發(fā)幼年大鼠哮喘，比較不同劑量的致敏原對幼年大鼠哮喘的氣道過敏性炎癥的作用，為治療和預(yù)防兒童哮喘的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

卵清蛋白（OVA，GradeⅡ，德國 Sigma公司）；氫氧化鋁；細(xì)胞因子檢測ELISA試劑盒（大鼠IL-4、OVA特異性IgE，德國Bender公司）；空氣壓縮式霧化器。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型 剛斷乳的SPF級雄性Wistar大鼠（中山大學(xué)動物實驗中心），平均體重（50±5）g。本學(xué)院SPF級動物房飼養(yǎng)，室溫（25±3）℃，相對濕度40%～60%，每日人工照明12 h，無菌操作。大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、OVA低劑量組、OVA中劑量組和OVA高劑量組，每組8只，依據(jù)分組不同分籠飼養(yǎng)，可以自由進(jìn)食不含特殊致敏原的純凈飼料和水。在飼養(yǎng)的第1天和第8天，低、中和高劑量組分別用 OVA（GradeⅡ）1 mg[5]、10 mg[6-7]和100 mg[8-9]+氫氧化鋁100 mg+生理鹽水1mL配制成混懸液在大鼠腹腔注射1 mL。對照組以生理鹽水代替OVA致敏，腹腔注射生理鹽水1 mL。在第15天，將低、中、高劑量組的大鼠置于20 cm×20 cm×30 cm大小的透明密閉容器內(nèi)，由霧化器提供霧化動力，以5%OVA（GradeⅤ）進(jìn)行霧化吸入激發(fā)，每次放4只大鼠，每次霧化30 min，連續(xù)6 d。正常對照組用生理鹽水代替OVA激發(fā)。最后1次激發(fā)后24 h[5]，用50 g/L戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射麻醉動物，腹主動脈采血4～5 mL，靜置2 h后3 000 r/min離心15 min，分離血清，于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。大鼠處死后打開胸腔，結(jié)扎左肺門，于右主支氣管注入生理鹽水3 mL行支氣管肺泡灌洗（BAL）術(shù)，每次1 mL，反復(fù)抽吸3次，回收率約80%，對回收的支氣管肺泡灌洗液（BALF）以1 500 r/min離心10 min，取上清液于-80℃冰箱保存，沉淀用1mL生理鹽水打勻，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。取左肺靠近肺門處的肺組織用中性甲醛固定，進(jìn)行病理組織切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察支氣管肺組織病理改變。

1.2.2 BALF細(xì)胞計數(shù) 在光學(xué)顯微鏡下，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)BALF中的細(xì)胞總數(shù)。

1.2.3 血清中IL-4和BALF中sIgE含量 以雙抗體夾心ELISA法測定，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清中IL-4和BALF中sIgE的含量。

1.2.4 肺組織病理分析 肺組織經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋及切片后，進(jìn)行HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)改變

低、中和高劑量組大鼠在霧化吸入OVA后5 min開始出現(xiàn)較明顯的抓鼻動作，進(jìn)而不同程度地出現(xiàn)呼吸增快、腹肌抽搐、四肢癱軟、行動遲滯、安靜少動、反應(yīng)遲鈍和前肢縮抬，而高劑量組有的出現(xiàn)張口呼吸，并逐漸俯伏在一起，取出動物后可見遺留較多排泄物。對照組未出現(xiàn)上述表現(xiàn)，偶見抓鼻，并自始至終保持常態(tài)。

2.2 不同劑量OVA對氣道炎癥的影響

2.2.1 大鼠BALF中的細(xì)胞計數(shù)結(jié)果 與對照組比較，低、中劑量組BALF中細(xì)胞總數(shù)的差異無顯著性，高劑量組明顯增高（P＜0.05）；高劑量組較低、中劑量組明顯增高（P＜0.05）；低劑量和中劑量組間差異無顯著性（見表1）。

表1 BALF中細(xì)胞總數(shù) （×106，±s）

表1 BALF中細(xì)胞總數(shù) （×106，±s）

注：1）與高劑量組比較，差異有顯著性，P＜0.05；2）與正常對照組比較，差異有顯著性，P＜0.05

組別 n 細(xì)胞總數(shù)低劑量組 8 1.82±1.001）中劑量組 8 3.25±0.601）高劑量組 8 10.67±3.792）正常對照組 8 1.34±0.31 F值 38.091 P值 0.000

2.2.2 大鼠血清IL-4改變 與對照組相比，高劑量組大鼠外周血輔助性T淋巴細(xì)胞2（Th2）細(xì)胞因子IL-4升高，差異有顯著性（P＜0.05），而與低、中劑量組的差異無顯著性；高劑量組較低劑量和中劑量組IL-4也顯著升高（P＜0.05）；低劑量和中劑量組比較，差異無顯著性（見表2）。

表2 各組大鼠血清IL-4的比較 （±s）

表2 各組大鼠血清IL-4的比較 （±s）

注：1）與高劑量組比較，差異有顯著性，P＜0.05；2）與正常對照組比較，差異有顯著性，P＜0.05

組別nIL-4的濃度/（pg/mL）低劑量組 8 1.92±1.451）中劑量組 8 13.02±12.101）高劑量組 8 76.38±48.662）正常對照組 8 0.54±0.36 F值 16.522 P值 0.000

2.3 大鼠肺組織病理學(xué)改變

肺組織HE染色可見：正常組（附圖A）的細(xì)小支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)完整，細(xì)支氣管腔和肺泡內(nèi)未見炎性滲出，細(xì)支氣管周圍偶見炎癥細(xì)胞；低劑量組（附圖B）和中劑量組（附圖C）的細(xì)支氣管壁稍有增厚，但結(jié)構(gòu)完整，細(xì)小支氣管和血管周圍可見中度炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)支氣管和肺泡腔內(nèi)無分泌物較少，中劑量組的支氣管部分萎縮；高劑量組（附圖D）的支氣管明顯萎縮，其上皮脫落并可見黏液栓，周圍炎性細(xì)胞明顯增多，血管周圍淋巴組織增生，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，其中嗜酸粒細(xì)胞（eosinophils，EOS）明顯增多。

2.4 大鼠BALF中sIgE水平

與正常對照組比較，中劑量和高劑量組大鼠的BALF中OVA特異性IgE明顯升高，差異有顯著性（P＜0.05），而低劑量組升高不明顯，差異無顯著性；高劑量組較低劑量和中劑量組大鼠BALF中的OVA-IgE也顯著增高，差異有顯著性（P＜0.05）；中、低劑量組間的差異也有顯著性（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠BALF中OVA-IgE的比較 （±s）

表3 各組大鼠BALF中OVA-IgE的比較 （±s）

注：1）與高劑量組比較，差異有顯著性，P＜0.05；2）與正常對照組比較，差異有顯著性，P＜0.05

組別nOVA-IgE的濃度/（μg/mL）低劑量組 8 4.31±1.821）中劑量組 8 10.38±1.551）2）高劑量組 8 22.06±8.052）正常對照組 8 1.69±1.18 F值 36.531 P值 0.000

附圖 各組大鼠肺組織病理性觀察（HE，×400）

3 討論

隨著我國城市化進(jìn)程的加速，目前哮喘已成為中國的第二大呼吸道疾病，并以兒童多發(fā)。嬰幼兒哮喘的發(fā)病率也在逐年上升。雖然哮喘的具體發(fā)病機(jī)制還不是很清楚，但是目前大部分學(xué)者研究認(rèn)為，TH亞群（Th1/Th2）比例失衡可能是哮喘發(fā)病中的一個重要環(huán)節(jié)或始動因素[10]。氣道高反應(yīng)（airway hyperresponsiveness，AHR）是哮喘的基本特征，氣道慢性炎癥是其基本病變，EOS在AHR和氣道炎癥中起核心作用，EOS浸潤是氣道病理改變的主要特征[11]。

哮喘病因復(fù)雜，動物模型種類繁多，使用哮喘動物模型進(jìn)行實驗時，應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇相應(yīng)模型，使其盡量接近人類疾病。兒童過敏性支氣管哮喘主要由吸入變應(yīng)原引起，故本實驗采用變應(yīng)原結(jié)合免疫佐劑系統(tǒng)致敏后，再經(jīng)氣道給予同一變應(yīng)原誘發(fā)哮喘的發(fā)生[12]。大鼠具有品系純、繁殖快、價格低、來源及相關(guān)試劑較豐富、標(biāo)本采集量大等特點，易產(chǎn)生遲發(fā)相哮喘反應(yīng)，反應(yīng)出現(xiàn)的時間與哮喘患者接近[13]，因而近年來大鼠模型的使用逐漸增多。而國內(nèi)外制造大鼠哮喘模型時，大多是輔助注射了百日咳桿菌菌苗來加強(qiáng)致敏作用[14]。

幼年哮喘模型的大鼠都是剛出生的大鼠，由于幼年大鼠體重較輕，抵抗力較弱，體表面積小，筆者在其他實驗中采用皮下多點注射操作顯示易造成動物皮內(nèi)腫塊，致使動物死亡率增高，并且多點皮下注射易造成幼鼠感染，從而影響實驗結(jié)果。因此，給幼年哮喘模型的建立造成了一些阻礙。SAKAI等[15]比較了不同劑量的致敏原對小鼠哮喘模型的影響，本實驗參考了國內(nèi)外多個實驗方法[16-21]，建立了幼年大鼠哮喘模型，并探討了不同劑量的致敏原造成哮喘的癥狀和表現(xiàn)的差異，希望摸索操作簡單、穩(wěn)定可重復(fù)的典型造模方法。實驗結(jié)果表明高劑量組的大鼠采用第1天和第8天腹腔注射OVA 100 mg+氫氧化鋁100 mg+生理鹽水1mL混懸液，其血清特異性IgE增高較中、低劑量組最為顯著；高劑量組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)異常，出現(xiàn)煩躁不安、呼吸增快、腹肌抽搐、大小便失禁等表現(xiàn)。肺組織病理切片可見支氣管及血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)可見EOS，支氣管明顯萎縮，管內(nèi)可見黏液栓；血清IL-4升高，BALF中OVA特異性IgE升高，與國內(nèi)外報道一致。而低劑量組和中劑量組血清IL-4不同程度升高，但與正常組相比差異無顯著性，中劑量組BALF中OVA-IgE升高明顯，與正常組比較差異有顯著性（P＜0.05）。

本方法操作經(jīng)濟(jì)簡便可行，劑量較易控制，為哮喘機(jī)制特別是氣道炎癥的研究提供了客觀有效的手段。筆者成功建立了與人類哮喘病變相似的幼年大鼠過敏性支氣管哮喘模型，比較了不同劑量的致敏原對哮喘發(fā)作的影響，為研究嬰幼兒哮喘的發(fā)作提供了典型的動物模型，為探討哮喘發(fā)病機(jī)制、篩選治療藥物提供了可靠的依據(jù)和途徑。理想的哮喘動物模型應(yīng)具備氣道變應(yīng)性炎癥和氣道高反應(yīng)性兩大特征[11]，但是本實驗室目前不具備測定動物氣道功能的設(shè)備和條件，僅能通過大鼠的癥狀表現(xiàn)和大鼠血清中特異性IgE來做推斷，對于過敏性炎癥與氣道反應(yīng)性的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

[1]GAO WL,QIU C,YUAN QL,etal.Thepathmorphology changes on the reconstitution of airway in asthma rat model[J].Guangdong Medical Journal,2006,27(2):176-178.

[2]ZOSKY GR,SLY PD.Animal models of asthma[J].Clinical and Experimental Allergy,2007,37:973-988.

[3]YOUSEF A.TAHER,BETTY C.A.M.VAN ESCH,GERARD A.HOFMAN,et al.1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Potentiates the Bene?cial Effects of Allergen Immunotherapy in a Mouse Model of Allergic Asthma:Role for IL-10 and TGF-β[J].Journal of Immunology,2008,180:5211-5221.

[4]MASAO H,YUKO I,MASA-AKI S,et al.Mechanism of Inflammation in Marine Eosinophilic Myocarditis Produced by Adoptive Transfer with Ovalbumin Challenge[J].Int Arch Allergy Immunol,2007,142:28-39.

[5]遲 磊,符 州,戴繼宏,等.過敏性哮喘大鼠模型的建立[J].重慶醫(yī)學(xué),2003,32(4):429-431.

[5]CHI L,FU Z,DAI JH,et al.The establishment of allergic asthma model of rat[J].Chongqing Medicine,2003,32(4):429-431.Chinese

[6]侯 敏,朱 明,馬秀敏,等.維藥神香草對哮喘大鼠血清白介素-17水平及Th1/Th2平衡的影響 [J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2010,20(3):365-368.

[6]HOU M,ZHU M,MA XM,et al.Effects of Uygur medicine Hyssopus officinalis L.on serum IL-17 level and balance of Th1/Th2 of asthma rats[J].China Journal of Modern Medicine,2010,20(3):365-368.Chinese.

[7]高亞東,熊盛道,徐勇健,等.一氧化氮對哮喘大鼠支氣管平滑肌細(xì)胞鉀通道的作用[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2003,10:615-618.

[7]GAO YD,XIONG SD,XU YJ,et al.The effect of nitric oxide on potassium channels of bronchial smooth muscle cells from asthmatic rats[J].Chinese Journal of Tuberculosis and Respiratory Diseases,2003,10:615-618.

[8] 王華光,張佳麗,王鶴堯,等.哮喘大鼠血清中 IL-4、IL-5、TNF-α和輔助性T淋巴細(xì)胞亞群的變化與哮喘關(guān)系的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(2):234-237.

[8]WANG HG,ZHANG JL,WANG HY,et al.Study on relationships between the changes of IL-4,IL-5,TNF-α,T-helper lymphocyte subsets in sera of asthmatic rats and bronchial asthma[J].China Journal of Modern Medicine,2009,19(2):234-237.Chinese

[9]王曉巖,遲寶榮,陳 漉.喘息康對支氣管哮喘大鼠外周血漿IFN-γ、IL-5、Eos和Eotaxin的影響 [J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2008,29(8):682-684.

[9]WANG XY,CHI BR,CHEN L.Effect of Chuangxikang decoction on peripheral plasma levers of IFN-γ,IL-5,Eos and eotaxin in bronchial asthma rat[J].Fourth Mil Med Univ,2008,29(8):682-684.Chinese

[10]MATHEU V,BACK O,MONDOC E,et al.Dual effects of vitamin D-induced alteration of TH1/TH2 cytokine expression:enhancing IgE production and decreasing airway eosinophilia in marine allergic airway disease[J].J Allergy Clin Immunol,2003,112:585-592.

[11]LIU CH,XUE QF,CHEN YZ.The research situation in the animal model of bronchial asthma[J].Chinese Journal of Tuberculosis and Respiratory Diseases,2000,23(11):647.

[12]SHI HZ.Correct understanding and rational application of the animal model of bronchial asthma[J].Chinese Journal of Tuberculosis and Respiratory Diseases,2005,28(11):749-750.

[13]ZHAO MH,ZHANG LF,ZHANG WP,et al.The quantitative study on airway inflammation of6asthma rat model[J].Journal of Zhejiang University,1997,26(3):100.

[14]LUO WL,LI HC,HAO HJ,et al.Effect of early exposure to allergen on rat asthmatic model[J].Journal of Peking University:Health Sciences,2006,38(2):159-163.

[15]SAKAI K,YOKOYAMA A,KOHNO N,et al.Effect of different sensitizing doses of antigen in a murine model of atopic asthma[J].Clin Exp Immunol,1999,118(1):9-15.

[16]WANG XF,HONG JG,ZHOU XJ.Vitamin D exacerbates airway inflammation in asthmatic rats[J].Shanghai Medical Journal,2008,31(1):27-29.

[17]LIGEIRO DE OLIVEIRA AP,DOMINGOS HV,CAVRIANI G,et al.Cellular recruitment and cytokine generation in a rat model of allergic lung inflammation are differentially modulated by progesterone and estradiol[J].Am J Physiol Cell Physiol,2007,293:1120-1128.

[18]LI CC,YE LP,CHEN XF,et al.Expression of signal transducer and activator of transcription 6 in rat asthma model and the modulatory effect of dexamethasone[J].Clin J Pediatr,2005,43(7):521-524.

[19]MARIE CJ,ANKE L,THOMAS T,REINHARD P.Kinetics of Regulatory T Cells in the Ovalbumin Asthma Model in the Rat[J].Int Arch Allergy Immunol,2009,149:16-24.

[20]ZHANG QL,ZHOU XJ,HONG JG.Effect of vitamin D supplementation in early life on airway hyperactivity and lung inflammation in rats with asthma[J].J Clin Pediatr,2009,27(5):476-479.

[21]MARIE CJ,ANKE L,THOMAS T,et al.Kinetics of regulatory T cells in the ovalbumin asthma model in the rat[J].Int Arch Allergy Immunol,2009,149:16-24.