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    遼寧地區(qū)漢族人群FOXP2基因單核苷酸多態(tài)性研究*

    2011-08-24 04:55:12趙云靜孫洪偉李書娟麻宏偉
    關(guān)鍵詞:多態(tài)連鎖等位基因

    趙云靜,孫洪偉,李書娟,麻宏偉

    (1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 發(fā)育兒科,遼寧 沈陽 110004;2.沈陽醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院 兒科,遼寧 沈陽 110024;3.遼陽石油化纖公司職工醫(yī)院 兒科,遼寧 遼陽 111003)

    Forkhead box P2(FOXP2)基因位于 7q31,是2001年人類發(fā)現(xiàn)的第一個言語相關(guān)基因,F(xiàn)OXP2基因突變可以導(dǎo)致嚴(yán)重的語言和言語障礙[1-2]。FOXP2基因的編碼產(chǎn)物FOXP2蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控其它基因的表達(dá)[3]。FOXP2基因是有關(guān)語言及言語障礙性疾病的重要候選基因。但我國目前有關(guān)FOXP2基因的研究少見,因此該基因的多態(tài)性在我國人群中的分布規(guī)律及特點尚不清楚?;蚨鄳B(tài)性在不同種族間差異很大,了解基因的多態(tài)性有利于明確人類種族差異,并且可用于進(jìn)行復(fù)雜性疾病的基因定位、疾病易感性研究。本研究選取FOXP2基因內(nèi) 5個單核苷酸多態(tài)位點:rs923875、rs2396722、rs1852469、rs17137124 和 rs1456031,對其等位基因及基因型頻率在我國遼寧地區(qū)漢族人群中的分布情況進(jìn)行了分析,為FOXP2基因相關(guān)疾病的研究提供參考數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    實驗所需主要試劑:平衡酚購自上海生工生物有限公司;蛋白酶K購自德國MERCK公司;Taq DNA聚合酶、dNTPs購自Takara公司;限制性內(nèi)切酶 ApalI、AflII、RsaI 及 VspI、Tru1I 分別購自美國NEB公司和MBI公司;DNA Marker DL-2000購自大連寶生物工程有限公司。引物由上海invitrogen公司合成。

    1.2 儀器與設(shè)備

    實驗所需主要儀器設(shè)備包括TGL-16G臺式高速離心機、TP600 型 PCR 擴增儀(Takara,Japan)、BG-Power600i電泳儀(BAYGENE公司)、HZS-H 恒溫水浴振蕩器、自動凝膠成像及分析系統(tǒng)、QIAQuick PCR purification kit及 ABI 3730 DNA測序儀。

    1.3 試驗方法

    選擇140名無血緣關(guān)系的遼寧地區(qū)健康體檢兒童作為研究對象,年齡4.5~12歲,均為漢族,既往健康,無遺傳性疾病及神經(jīng)、精神疾病史。

    1.3.1 基因組DNA提取 留取受試者外周靜脈血2 mL,經(jīng)EDTA抗凝,分離白細(xì)胞,按照常規(guī)酚-氯仿異戊醇法提取基因組DNA。

    1.3.2 PCR擴增目的基因片段 采用PCR擴增目的基因片段,引物選自參考文獻(xiàn)[4]或采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計,由invitrogen公司合成。 PCR反應(yīng)總體積為20μL,包括10×緩沖液(2.5 mmol/L plus Mg+)1.25μL,2.5 mmol/L dNTP 1μL,10 pmol上游、下游引物各0.1~0.5μL,DNA模板1~2μL,1~2u Taq聚合酶。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3~4 min,94℃變性 30~40 s、55~61℃退火 40~60 s、72℃延伸 50~60 s、30~35 個循環(huán),72℃延伸 7 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠檢測,若目的電泳帶清晰、無雜帶,表明PCR擴增成功。各引物序列詳見表1。

    表1 各SNPs位點及PCR擴增引物序列

    1.3.3 PCR-RFLP分析及基因分型 PCR產(chǎn)物擴增成功后選用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切分析,配制20μL酶切反應(yīng)體系:PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μL,10×Buffer 2μL,內(nèi)切酶 0.5~0.8μL,加 ddH2O 至20μL。放置于水浴箱中消化3 h。酶切消化結(jié)束后加入10×Loading buffer 2.0μL終止酶切反應(yīng)。將酶切反應(yīng)產(chǎn)物加至2%或2.5%的瓊脂糖凝膠上樣孔中,設(shè)定電壓100 V,在1×TBE溶液中電泳40~60min。電泳結(jié)束后在凝膠自動成像系統(tǒng)中成像掃描,記錄各樣本SNPs的等位基因型。各SNPs位點限制性內(nèi)切酶及酶切產(chǎn)物詳見表2。

    1.3.4 直接測序 根據(jù)酶切電泳圖隨機選取不同條帶的樣本進(jìn)行PCR擴增,每個SNP位點共選取6個樣本,PCR反應(yīng)體系50μL,PCR反應(yīng)條件同前,擴增成功后進(jìn)行直接測序分析。PCR產(chǎn)物純化應(yīng)用QIAQuick PCR purification kit(Qiagen,Germany)進(jìn)行,在 ABI 3730 DNA 測序儀(Perkin Elmer,F(xiàn)oster city,California,USA)進(jìn)行測序。測序結(jié)果與酶切分析結(jié)果及GeneBank數(shù)據(jù)庫中人類FOXP2基因NC_000007.12序列進(jìn)行比較。

    表2 各SNPs位點限制性內(nèi)切酶及酶切產(chǎn)物

    1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

    各多態(tài)位點的基因型和等位基因型采用百分率表示,根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律計算各多態(tài)位點基因型的期望值,采用χ2檢驗進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗。組間等位基因頻率的比較采用χ2檢驗,數(shù)據(jù)處理采用SPSS12.0軟件包,P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。各位點間的遺傳相關(guān)性分析采用連鎖不平衡檢驗,數(shù)據(jù)處理采用在線分析程序SHEsis online program[5]。

    2 結(jié)果

    2.1 遼寧地區(qū)漢族健康人群FOXP2基因SNP的Hardy-Weinberg定律吻合度檢驗

    FOXP2基因內(nèi)的 5個 SNPsrs923875、rs2396722、rs1852469、rs17137124 和 rs1456031 在遼寧地區(qū)漢族人群中均有多態(tài)性,其基因型及等位基因頻率分布見表3,經(jīng)Hardy-Weinberg吻合度檢驗 ,rs923875、rs2396722、rs1852469、rs17137124 和rs1456031位點P>0.05,表明本研究群體中各位點的頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,表明樣本具有群體代表性。實驗中,有個別樣本的FOXP2基因單核苷酸多態(tài)位點經(jīng)多次PCR或酶切反應(yīng)仍不成功,未能成功分型,其中包括rs2396722位點2例,rs1852469位點3例,rs1456031位點2例。見表3。

    2.2 遼寧地區(qū)漢族健康人群與其他人種FOXP2基因SNPs比較

    本研究將結(jié)果與其他種族人群的有關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較,結(jié)果顯示FOXP2基因5個多態(tài)位點等位基因分布與西班牙高加索人比較差異均有顯著性。此外,rs923875位點的等位基因頻率與歐洲裔美國人比較也存在明顯差異(P<0.05),與美國黑人相比沒有明顯差異(P>0.05);rs1852469位點的基因頻率與歐洲裔美國人、尼日利亞約魯巴人相比差異顯著(P<0.05),與日本人相比差異無顯著性(P>0.05);rs17137124位點的等位基因頻率與尼日利亞約魯巴人比較有明顯差異(P<0.05),與歐洲裔美國人、日本人比較差異無顯著性(P>0.05)。詳見表4。

    表3 各SNPs基因型和等位基因頻率及Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗

    表4 遼寧地區(qū)漢族健康人群FOXP2基因多態(tài)分布及與其他人種比較

    2.3 遼寧地區(qū)漢族人群FOXP2基因5個SNPs之間連鎖不平衡檢驗

    連鎖不平衡分析結(jié)果顯示,遼寧地區(qū)漢族人群FOXP2基因rs2396722與rs923875之間存在中等程度連鎖關(guān)系,rs2396722與rs17137124存在中等程度連鎖關(guān)系,其余各多態(tài)位點間存在較弱的連鎖不平衡。見表5。

    表5 140名遼寧地區(qū)漢族人群FOXP2基因多態(tài)性連鎖不平衡分析

    DNA測序結(jié)果:測序結(jié)果均與酶切結(jié)果相符,也未發(fā)現(xiàn)其他序列變異。

    3 討論

    FOXP2基因編碼的FOXP2蛋白包括一個多谷氨酸鹽束、一個鋅指、一個亮氨酸拉鏈基序和一個叉頭框DNA結(jié)合區(qū)[1,6],在成人及胎兒腦組織存在高表達(dá)[7]。FOXP2基因所在的染色體7q31缺失或斷裂病例均有嚴(yán)重的語言和言語障礙[8-10],進(jìn)一步證實FOXP2基因是重要的言語相關(guān)基因。此外,F(xiàn)OXP2蛋白可以調(diào)控其它基因在發(fā)育中的肺組織、心血管、腸道和神經(jīng)組織的表達(dá)。迄今為止,在人腦包括神經(jīng)軸突、額皮質(zhì)下層已發(fā)現(xiàn)多個FOXP2基因的靶向基因[11]。SPITERI E[12]的體外研究已經(jīng)證實FOXP2基因的調(diào)控作用,而且,其中很多FOXP2基因的靶基因?qū)τ谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)育如神經(jīng)軸突的生長起到關(guān)鍵性作用。2008年,新英格蘭雜志報道FOXP2基因可以下調(diào)CNTNAP2基因[13],CNTNAP2基因編碼突觸前膜外伸蛋白(neurexin),在突觸發(fā)生和突觸傳遞等過程中發(fā)揮重要作用[14]。

    SNPs,即單核苷酸多態(tài)性,是1996年由美國麻省理工學(xué)院人類基因組研究中心負(fù)責(zé)人lander提出的一類新型標(biāo)記,是指染色體基因水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性,在人群中發(fā)生頻率大于1%。與微衛(wèi)星相比,SNP具有穩(wěn)定性高的特點,從而避免了標(biāo)記的高突變率給人群遺傳分析帶來的困難。此外,位于基因編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)的SNP有可能直接影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或者表達(dá)水平。因此,SNPs被廣泛應(yīng)用于疾病易感基因的定位及連鎖和關(guān)聯(lián)分析。然而各多態(tài)位點的基因型及等位基因頻率在不同種族、不同群體之間均存在很大差異。因此,有必要研究基因多態(tài)性在不同人群的分布特點以便于進(jìn)一步的遺傳分析。

    本研究以遼寧地區(qū)漢族人群為研究對象,對言語相關(guān)基因 FOXP2的 5個 SNPs:rs923875、rs2396722、rs1852469、rs17137124 和 rs1456031 的基因型及等位基因頻率進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示5個多態(tài)位點在遼寧地區(qū)漢族人群中均有多態(tài)性,其中rs923875的等位基因A、C的頻率分別為0.368和0.632;rs2396722的等位基因 C、T的頻率分別為0.551和0.449;rs1852469的等位基因A、T的頻率分別為0.464和0.536;rs17137124的等位基因C、T的頻率分別為0.621和0.379;rs1456031的等位基因 C、T的等位基因頻率為 0.547和 0.453。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗,5個多態(tài)位點的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。

    筆者同時對以上5個SNPs之間進(jìn)行了配對連鎖不平衡分析,用D’值表示連鎖不平衡程度。D’值位于0到1之間,一般將D’<0.3看作較弱的連鎖不平衡,0.3<D’<0.7 為中等程度的連鎖不平衡,D’>0.7為較高程度的連鎖不平衡。本研究結(jié)果顯示,rs2396722與 rs923875,rs2396722與 rs17137124之間存在中等程度的連鎖不平衡,rs2396722與rs923875均位于FOXP2基因5’非翻譯區(qū),二者之間相距94.4kb,rs2396722與rs17137124相距247.8 kb。其余多態(tài)位點間存在較弱的連鎖不平衡。目前關(guān)于控制連鎖不平衡的各種因素的研究尚處于初級階段[15],影響連鎖不平衡的因素較多,其中突變及重組最為研究者所關(guān)注。

    筆者對5個SNPs的等位基因在不同種族人群中的分布情況進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn):遼寧地區(qū)漢族人群FOXP2基因5個多態(tài)位點等位基因分布與西班牙高加索人比較差異均有顯著性。此外,rs923875位點的等位基因頻率與歐洲裔美國人比較也存在明顯差異(P<0.05),與美國黑人相比沒有明顯差異(P>0.05);rs1852469位點的基因頻率與歐洲裔美國人、尼日利亞約魯巴人相比差異顯著(P<0.05),與日本人相比無顯著性差異(P>0.05);rs17137124位點的等位基因頻率與尼日利亞約魯巴人比較有明顯差異(P<0.05),與歐洲裔美國人、日本人比較差異無顯著性(P>0.05)。由于國內(nèi)尚無其他地區(qū)人群FOXP2基因相關(guān)研究數(shù)據(jù),所以本文未能與國內(nèi)其他地區(qū)或民族進(jìn)行比較。

    2004年,GONG氏[16]等選擇 FOXP2基因rs1852469、rs1456031及rs2396753三個位點對181個孤獨癥家系進(jìn)行傳遞不平衡研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs1456031可能與漢族兒童孤獨癥有關(guān)。SANJUáN J[17]等研究了149名精神分裂癥患者rs923875的等位基因頻率分布并與137名正常對照進(jìn)行比較,沒有發(fā)現(xiàn)有意義的陽性結(jié)果。PADOVANI A[18]等對210例伴有語言障礙的額顳葉變性患者和200名正常對照進(jìn)行的FOXP2基因 rs2396753、rs1456031、rs17137124及rs1852469四個多態(tài)位點的研究中也未發(fā)現(xiàn)基因型和等位基因頻率的差異,但結(jié)果顯示rs1456031TT和rs17137124TT基因型與言語流暢性測驗得分相關(guān)。筆者選擇本文研究的5個多態(tài)位點進(jìn)行了FOXP2基因與功能性構(gòu)音障礙的相關(guān)性研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):rs1852469T等位基因可能是決定疾病易感性的重要因素[19],提示FOXP2基因可能與功能性構(gòu)音障礙相關(guān)。

    綜上所述,F(xiàn)OXP2基因的5個SNPs:rs923875、rs2396722、rs1852469、rs17137124 及 rs1456031 在我國遼寧地區(qū)漢族人群中均有多態(tài)性;與其他種族人群相比,5個多態(tài)位點的等位基因頻率在不同種族間存在差異。這將為有關(guān)FOXP2基因的研究及語言障礙相關(guān)疾病的群體研究提供依據(jù)和基礎(chǔ),這5個SNPs可以作為遺傳標(biāo)記用于語言言語障礙類疾病的關(guān)聯(lián)分析及連鎖分析。最近,TOLOSA[20]等發(fā)現(xiàn)SNP rs2253478與精神分裂癥的言語障礙有關(guān)。因此,F(xiàn)OXP2基因的其他SNPs的分布特點有待于今后的繼續(xù)研究。

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