熱敏脂質(zhì)體介導(dǎo)的仿生礦化膠原凝膠的基礎(chǔ)研究*

王燕坤 王 茜 武軍駐 蔡潔明

基質(zhì)小泡是細(xì)胞源性膜性成份,平均直徑30mm-100nm，經(jīng)常出現(xiàn)在肥大軟骨，骨和牙齒等礦化組織內(nèi)。含有天然或人工合成的磷脂的小泡即為脂質(zhì)體。由于與生物膜很相似，近幾年成為研究熱點(diǎn)。例如非病毒基因載體[1]和載藥系統(tǒng)[2]。另外，脂質(zhì)體能像“微型反應(yīng)器”一樣提供一個(gè)相對(duì)保護(hù)性封閉的環(huán)境。脂質(zhì)體的這個(gè)性質(zhì)為其模擬基質(zhì)小泡提供了可能性。因此以脂質(zhì)體為工具來(lái)研究基質(zhì)小泡介導(dǎo)的生物礦化有無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)。

Pederson等應(yīng)用合成的脂質(zhì)體作為工具塑造熱敏脂質(zhì)體和溫控自組裝膠原形成可注射性前驅(qū)液[3]。但是其IF法合成脂質(zhì)體體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于基質(zhì)小泡體積；存在膠原凝膠機(jī)械力不足；膠原降解速度快等缺點(diǎn)。

在前期研究[4]的基礎(chǔ)上，本研究擬采用薄膜-超聲法制備出小直徑的載Ca2+和Pi脂質(zhì)體模擬基質(zhì)小泡，觀察其特征并研究在早期齲模型上的應(yīng)用。然而，在骨組織中礦化晶體是沉積在膠原纖維上，因此，我們將酸可溶性膠原引入，重建為礦化膠原溶液。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料 RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國(guó))、DM4000B正置顯微鏡(萊卡，德國(guó))、S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(日立公司,日本)、DPPC(二棕櫚酰磷脂酰膽堿 ＞99%，Avanti Polar Lipids公司,美國(guó))、DMPC(二肉豆蔻酰磷脂膽堿＞99%，Avanti Polar Lipids公司,美國(guó))、CaCl2(分析純，中國(guó))、Na2HPO4(分析純，中國(guó))、自制大白鼠尾膠原等。

1.2 載Ca2+和Pi-脂質(zhì)體的制備 采用逆向蒸發(fā)——超聲法合成脂質(zhì)體。將DPPC與DMPC按摩爾比9∶1混入燒瓶中，共20mg，向其中加入3ml氯仿。真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成一層薄膜。緩慢地加入1ml CaCl2溶液(0.2M)，45℃水浴下?lián)u晃水合10min。50℃下超聲4min，直至液體變清亮。冷卻至室溫6500rpm離心12min。室溫下向瓶中加入等體積的 NaCl溶液(0.285M)。渦旋混勻，14000rpm離心30min，保留沉淀。至少重復(fù)上述步驟六次，用比色法測(cè)直到無(wú)游離的離子，即得純的載Ca2+脂質(zhì)體懸液。同理制備載Pi的脂質(zhì)體，測(cè)定各自的包封率。

1.3 膠原溶液的制備 取干燥I型自制鼠膠原，配制1.05mg/ml膠原溶液，使膠原濃度在最后的前驅(qū)液中為0.7mg/ml。

1.4 熱觸發(fā)自組裝型HA/膠原復(fù)合體的制備先將載Ca2+和載Pi脂質(zhì)體以2∶1(V∶V)混合，然后迅速將兩種液體以1∶2(脂質(zhì)體V∶膠原V)混合制成前驅(qū)液(即熱觸發(fā)自組裝型HA/膠原復(fù)合體)。

1.5 脂質(zhì)體基本特征的測(cè)定

1.5.1 脂質(zhì)體直徑的測(cè)定 按上述方法制備載Ca2+或Pi的脂質(zhì)體懸液。提取微量液體，用NaCl溶液(0.285M)稀釋，置入粒度分析儀,每個(gè)樣本重復(fù)3-5次。

1.5.2 載Pi脂質(zhì)體相變溫度的測(cè)定 用微熱量?jī)xC-80(SETARAM公司，法國(guó))測(cè)量相變溫度。

1.5.3 脂質(zhì)體熱穩(wěn)定性的評(píng)估 室溫下，將1ml載Ca2+脂質(zhì)體放于14 ml NaCl(0.285 M)內(nèi)儲(chǔ)存。選定特定的時(shí)間，采用上述的AIII(偶氮砷III)比色測(cè)試法測(cè)定脂質(zhì)體膜外的游離的Ca2+。

1.6 脂質(zhì)體混懸液在早期齲模型上的應(yīng)用 制厚度為1mm無(wú)齲的第三磨牙的磨片，用10%H3PO4酸蝕清洗20 s，用蒸餾水清洗。將直徑2cm高度3cm的金屬圓柱體,置于恒溫器中水浴，水位止于2.8cm暴露其余部分，將磨片置于其上，控制使其保持在37℃，將載Ca2+和載Pi脂質(zhì)體以2∶1(V：V)混合，倒入磨片的表面，保持靜止20min,接著移走磨片。室溫下蒸餾水清洗去除殘留的懸浮液。標(biāo)本風(fēng)干1h,另外真空中風(fēng)干24h。掃描電鏡觀察磨片表面的礦化情況。

1.7 凍干膠原凝膠的SEM和元素分析 將上述前驅(qū)液在37℃恒溫孵育箱中放置24h，待形成凝膠固體狀的HA/膠原復(fù)合體后，將其放入冷凍干燥機(jī)中真空冷凍干燥8個(gè)小時(shí)。取部分樣品噴鉑，掃描電鏡觀察。然后用Horbia EX-250型能譜儀對(duì)其進(jìn)行元素分析。

2.結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的基本特征 大部分載鈣和磷酸鹽脂質(zhì)體平均直徑分別是1.5μm和1.3μm；包封率分別是56%-67%和42%-66%。脂質(zhì)體其相變溫度在39℃有一個(gè)吸熱峰值(圖1所示)。

圖1 C-80微熱量?jī)x掃描由DMPC和DPPC構(gòu)成的載Pi脂質(zhì)體懸浮液相變溫度。

本實(shí)驗(yàn)合成脂質(zhì)體在室溫條件下儲(chǔ)存一段時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)載Ca2+脂質(zhì)體泄漏率低于5%(圖2所示)。載Ca2+脂質(zhì)體溫控敏感性是采用偶氮胂III(AIII)分光光度法原理。當(dāng)僅僅有AIII時(shí)有一個(gè)450-610nm波段其吸收峰值是543nm(圖3a實(shí)心箭頭所示)，當(dāng)在Ca2+出現(xiàn)時(shí)形成Ca2+-AIII的復(fù)合物，故顯示為很小的特征肩峰在630nm(圖3b箭頭所示)。室溫下用稀釋純載鈣脂質(zhì)體與AIII混合，顯示一個(gè)與單純AIII很接近的吸收光譜曲線(圖3a,實(shí)線所示)。但是把載鈣脂質(zhì)體在體溫條件下加熱30min，使從Ca2+離子從脂質(zhì)體釋放出來(lái)可以發(fā)現(xiàn)明顯的吸收光譜圖的改變；在543nm的AIII峰值出現(xiàn)的同時(shí)出現(xiàn)一個(gè)新的572-611nm的峰值(圖3a,紅線所示)，相當(dāng)于是Ca2+-AIII的復(fù)合物。

圖2 純載Ca2+脂質(zhì)體在室溫條件下儲(chǔ)存幾周后，與時(shí)間相關(guān)泄漏率。(原始數(shù)據(jù)吸光值轉(zhuǎn)變?yōu)榘俜謹(jǐn)?shù))

圖3a 在室溫和體溫條件下用AIII測(cè)定Ca2+釋放紫外光譜情況紅線：37℃下Ca2+脂質(zhì)體+AIII虛線：只有AIII實(shí)線：在室溫條件下AIII+Ca2+脂質(zhì)體

圖3 bAIII和CaCl2(0.2 M)溶液紫外光譜圖，箭頭所示Ca2+-AIII的復(fù)合物出現(xiàn)的峰值

2.2 早期齲模型觀察結(jié)果 早期齲表面的釉晶是不連續(xù)性的破壞。于是用酸蝕后牙齒磨片模擬早期齲壞，將其浸泡在脂質(zhì)體生物礦化溶液中。在室溫條件，在釉質(zhì)表面無(wú)明顯物質(zhì)存在(圖4b，4e所示)；然而在體溫條件下，在牙釉質(zhì)表面可見到片狀晶體存在(圖4c所示)；并且在牙本質(zhì)小管間可以看到一些分離的簇集狀物質(zhì)(圖4f所示)。

2.3 凍干礦化膠原凝膠的性質(zhì) 在電鏡掃描下，可發(fā)現(xiàn)礦物質(zhì)分布于膠原之間隨意分布(圖5a所示)；以及在礦化凝膠中出現(xiàn)的六邊形物質(zhì)是羥基磷灰石(圖5b箭頭所示)，因?yàn)樗裱u基磷灰石六邊形，片狀，晶體c軸延長(zhǎng)晶體學(xué)特點(diǎn)。能譜儀分析顯示很強(qiáng)磷酸鹽(2.0 keV)和鈣峰值(3.7 keV)(圖 6 所示)。

3.討論

臨床上有多種原因造成的牙槽骨量的喪失；特別是老年因腫瘤手術(shù)造成的上下頜骨缺損，為義齒修復(fù)帶來(lái)很多的困難；牙槽嵴高度與寬度不足致下頜磨牙區(qū)狹窄，使種植體不能穩(wěn)定負(fù)載等。采用適當(dāng)?shù)姆椒ɑ謴?fù)牙槽骨量可直接影響義齒修復(fù)的效果，經(jīng)過(guò)多年的研究出現(xiàn)了諸多修復(fù)牙槽骨缺損的填充材料[5]，但未達(dá)到理想效果。本研究采用脂質(zhì)體模擬基質(zhì)小泡介導(dǎo)的生物礦化過(guò)程，合成復(fù)合材料的成分和合成過(guò)程與天然骨相似。另外，脂質(zhì)體可以持續(xù)釋放包封離子，具有緩釋效果；前驅(qū)液有良好的流動(dòng)性從而可在臨床注射性應(yīng)用達(dá)到微創(chuàng)效果。

為模擬基質(zhì)小泡介導(dǎo)的礦化過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)采用薄膜超聲法合成的小型單層脂質(zhì)體是理想的結(jié)果；因?yàn)樾≈睆降闹|(zhì)體更接近基質(zhì)小泡的直徑。然而本實(shí)驗(yàn)中脂質(zhì)體的包封率比Pederson等的研究[6]的要低些(載Ca2+和Pi脂質(zhì)體包封率分別是(60%-75%和75%-85%)。原因是其IF法合成的脂質(zhì)體體積比較大，可以包封較多的溶液；另外，超聲使得溶液極性分子與磷脂膜之間及磷脂分子之間相互作用發(fā)生改變，從而使得內(nèi)容物釋放，包封率也有所下降。

圖4a 酸蝕后未作處理的牙釉質(zhì)磨片的表面；圖4b在室溫條件下在載Ca2+和Pi的脂質(zhì)體混合液孵育20min后牙釉質(zhì)的表面，未見明顯覆蓋物；圖4c在37℃混合脂質(zhì)體孵育20min后，在釉質(zhì)表面可見不定型物質(zhì)覆蓋；圖4d酸蝕后未作處理的牙本質(zhì)的表面；圖4e在室溫條件下在載Ca2+和Pi的脂質(zhì)體混合液孵育20min后牙本質(zhì)的表面，未見明顯覆蓋物；圖4f在37℃混合脂質(zhì)體孵育20min后，在牙本質(zhì)表面可見不連續(xù)覆蓋物

圖5a 低倍電鏡下凍干膠原凝膠的掃描圖；圖5b高倍鏡下凍干膠原凝膠的掃描圖，箭頭顯示六邊形狀微粒可能為無(wú)定形羥基磷灰石；圖5c高倍鏡下的凍干礦物質(zhì)/膠原復(fù)合物，可見無(wú)序排列的結(jié)構(gòu)

圖6 凍干礦物質(zhì)/膠原復(fù)合物凝膠EDS能譜圖

載Pi脂質(zhì)體在39℃有一個(gè)吸熱峰值(圖1所示)，表明脂質(zhì)體膜由“凝膠態(tài)”轉(zhuǎn)變?yōu)椤耙簯B(tài)”。相變開始的偏差是由于熱量平衡波動(dòng)過(guò)程所致。然而載Pi脂質(zhì)體在低于Tm的體溫條件下釋放內(nèi)含離子是合理的。首先，磷脂-水溶液系統(tǒng)的獨(dú)特特點(diǎn)，即雙相系統(tǒng)的相行為特點(diǎn)，不僅包含脂質(zhì)體的相特點(diǎn)還包括溶液的相特點(diǎn)；研究表明[7]加入磷酸鹽的DPPC導(dǎo)致它的相變溫度有所增加。另外，脂質(zhì)體雙分子層在低于Tm時(shí)滲透性會(huì)增加。Pederson等研究同樣組分的載Ca2+脂質(zhì)體的相變溫度(Tm)也高于體溫，是由Ca2+和磷脂雙分子層的相互作用所致[8]。

本實(shí)驗(yàn)合成的載Ca2+脂質(zhì)體在室溫條件下儲(chǔ)存近6周，泄漏率低于5%，表明脂質(zhì)體穩(wěn)定性良好。在脂質(zhì)體的制備過(guò)程中，超聲可能對(duì)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響；另外，可能是由于脂質(zhì)體內(nèi)外的濃度差([Ca]in=0.2M;[Ca]out≈0M)導(dǎo)致擴(kuò)散作用；包封的溶液可從脂質(zhì)雙分子層的小空隙或溝中滲透出來(lái)。

在本實(shí)驗(yàn)中合成的無(wú)定形磷酸鈣鹽(如圖5c所示)與缺乏釉基質(zhì)蛋白形成的羥基磷灰石相一致[9]。與低飽和度的礦化液相比，在高飽和度的礦化液中，形成比較少的有序結(jié)構(gòu)[10]。在我們的研究中，高濃度的溶液恰好驗(yàn)證這個(gè)事實(shí)。

基質(zhì)小泡分布于成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞附近含有大量膠原的類骨質(zhì)中，小泡破裂后可使鈣鹽結(jié)晶成為鈣化中心，最終形成骨。在本實(shí)驗(yàn)中引入的I型膠原可作為細(xì)胞外基質(zhì)，它能加速愈合和血管化；確定晶體生長(zhǎng)的空間，這個(gè)限制的生長(zhǎng)空間對(duì)確定晶體的體積和形態(tài)是非常重要的；膠原容易降解并易于細(xì)胞粘附和繁殖。羥基磷灰石是人體自然骨的主要成分，具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)性。因此我們結(jié)合膠原以及脂質(zhì)體破裂后形成的磷酸鈣鹽二者優(yōu)點(diǎn)，最終合成的骨替代材料具有其獨(dú)特的優(yōu)越性。

目前熱敏礦化膠原凝膠材料還處于實(shí)驗(yàn)階段，還有許多問(wèn)題亟待解決。如合成的礦化膠原凝膠的機(jī)械性性能，生物學(xué)相容性及進(jìn)一步去模擬體內(nèi)條件下的礦化將是未來(lái)研究重點(diǎn)。

4.結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用脂質(zhì)體包封鹽溶液，模擬基質(zhì)小泡；在體溫條件下與酸性膠原溶液反應(yīng)形成膠原凝膠。脂質(zhì)體具有良好的穩(wěn)定性和熱敏感性，在體溫誘導(dǎo)下可快速形成類似于骨組織礦化物。顯示它在醫(yī)學(xué)和牙科種植材料方面有應(yīng)用潛力。

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