健脾消癌方對結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞遷移、侵襲的影響研究*

簡小蘭，曾普華，杜佳，何鳳姣，李克雄，蔣益蘭

1.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南長沙410006；2.中醫(yī)腫瘤學(xué)湖南省重點實驗室，湖南長沙410006；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer）在全球的發(fā)病率及死亡率均處于第3位。近年來隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，在早期診斷方面有所進展，仍有1/3的患者在確診時已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移［1-2］，5年總體生存率低于50%［3］。引起結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因——侵襲及轉(zhuǎn)移［4-5］，積極探索復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機制并進行阻斷是提高結(jié)直腸癌患者生存率的關(guān)鍵。大量的臨床研究均顯示中醫(yī)藥在結(jié)直腸癌的綜合治療中發(fā)揮重要作用［6-8］。中醫(yī)藥具有抗腫瘤、抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)免疫力、提高生活質(zhì)量、延長生存期等作用。多年的臨證研究證實，健脾消癌方抗結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有良好療效［9-12］，但其機制尚未完全闡明。本研究從癌細(xì)胞遷移、侵襲力方面，運用血清藥理學(xué)方法研究健脾消癌方對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及侵襲作用的影響，進一步探討健脾消癌方抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移療效機制，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物和細(xì)胞株SD大鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半，合格證號:SYXK（湘）2015-008。人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購買于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，編號TCHu 99。

1.2 藥物健脾消癌方主要藥物是人參10 g，薏苡仁30 g，重樓10 g，半枝蓮30 g，郁金15 g，莪術(shù)10 g，從湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房購買。取上述2倍量藥物，用水浸泡1 h，水量超出藥物3～5 cm，大火煮沸后轉(zhuǎn)小火煎30 min，過濾，藥渣按前法再煎煮2次，將3次藥液混勻、過濾，減壓濃縮為相當(dāng)于生藥1.5 g·mL-1，4℃保存，1周內(nèi)用完。

1.3 試劑與儀器胎牛血清（以色列Biological industries公司，批號:1616316）；DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號:NZD1131）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號:P0012）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號:P0013b）；結(jié)晶紫（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號:C0121）；MMP-2（美國Abcam公司，貨號:ab92536）；MMP-9（美國Abcam公司，貨號:ab228402）；β-actin（美國Abcam 公司，貨號:ab6276）；山羊抗兔IgG（康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號:01325）；山羊抗小鼠IgG（康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號:50237）。

細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Hoefer電泳（美國Hoefer公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Syngene公司）；EIX808U型全自動酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）。

2 方法

2.1 含藥血清的制備SD大鼠20只，雌雄各半，隨機分成2組，每組10只。實驗組按10.8 g·kg-1（相當(dāng)于70 kg成年人120 g·d-1的等效量）灌胃；對照組以等容積的生理鹽水灌胃。每天灌胃1次，連續(xù)7 d，第7天灌胃1 h后，10%水合氯醛（0.3 mL·100 g-1）腹腔麻醉，腹主動脈采血，血液4℃保存，24 h內(nèi)離心，收集合并同組動物血清，微孔濾膜（0.22μm）過濾除菌，保存于-20℃冰箱。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)HCT116細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)液中，置于37℃，5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底約90%時，進行細(xì)胞傳代，更換培養(yǎng)液，傳代比率為1∶2或1∶3。需要進行實驗處理時，取匯合率為80%的對數(shù)期細(xì)胞。

2.3 細(xì)胞劃痕實驗取對數(shù)生長期HCT116細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105mL-1，按每孔2 mL接種于6孔板中，待細(xì)胞長滿后，吸棄培養(yǎng)液，將一張事先畫有直線的紙放于6孔板下，各直線間隔適中，用100μL槍頭沿直線劃痕，每孔3條，PBS沿壁輕輕沖洗細(xì)胞3遍，吸棄PBS，分別加入濃度為10%、15%、20%的含藥血清培養(yǎng)液2 mL，10%、15%、20%的鼠對照血清培養(yǎng)液2 mL，及10%胎牛血清為陰性對照組，每組設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h、48 h后取出培養(yǎng)板，有脫落細(xì)胞影響觀察則予以更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡（×50）任意選取5個不同視野拍照，測量劃痕的距離。

2.4 Transwell檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力侵襲實驗選用Transwell小室（孔徑8μm），首先制備含Matrigel膠的Transwell小室。取對數(shù)期生長HCT116細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105mL-1，接種于6孔板，分別以10%、15%、20%含藥血清和10%、15%、20%鼠對照血清，10%胎牛血清處理細(xì)胞。24 h后收集細(xì)胞，用DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞均調(diào)整密度為2×106mL-1，分別取100μL各組細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室，24孔板下室加入600μL含15%的胎牛血清（FBS）培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，取出小室清洗，4%的多聚甲醇固定15 min，晾干10 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗3遍，33%的醋酸將Transwell膜上細(xì)胞洗滌下來，酶標(biāo)儀570 nm波長讀取OD值，計算細(xì)胞遷移抑制率。遷移實驗除不在小室鋪膠外，其余步驟同侵襲實驗。

遷移抑制率＝［（胎牛血清對照組平均吸光值-實驗組平均吸光值）/胎牛血清對照組平均吸光值］×100%

2.5 Western Blot法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）蛋白的表達(dá)以15%的有效濃度處理細(xì)胞，15%鼠血清對照組、10%的FBS為陰性對照組，干預(yù)48 h，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗細(xì)胞3次，加入含有4μL的含PMSF的RIPA緩沖液400μL，冰上裂解30 min，4℃、12 000 g離心15 min，取上清，BCA試劑盒進行蛋白定量，按照比例加入SDS-PAGE蛋白緩沖液，煮沸5 min，立即分裝，置-80℃?zhèn)溆?。?0μg蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，封閉，一抗室溫孵育4 h、二抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光，分別檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)水平，β-actin為內(nèi)參。以Image J軟件分析結(jié)果。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 健脾消癌方對細(xì)胞劃痕的影響健脾消癌方含藥血清處理24 h、48 h后，含藥血清劃痕距離寬于相同濃度空白血清組。處理24 h，與相同濃度鼠血清對照組相比，10%、15%、20%的含藥血清組劃痕距離均較明顯增寬（P＜0.05）；處理48 h，與相同濃度鼠血清對照組相比，10%、15%、20%的含藥血清組劃痕距離均較顯著增寬（P＜0.01），且濃度越大劃痕距離越大。同濃度含藥血清，對細(xì)胞遷移抑制能力48 h優(yōu)于24 h。說明健脾消癌方能夠抑制HCT116細(xì)胞的遷移，其抑制作用與濃度和時間呈正相關(guān)。見圖1、圖2、圖3，表1。

圖1 含藥血清對HCT116細(xì)胞劃痕距離的影響

圖2 對照鼠血清對HCT116細(xì)胞劃痕距離的影響

圖3 胎牛血清對HCT116細(xì)胞劃痕距離的影響

3.2 健脾消癌方對細(xì)胞遷移的影響處理24 h后，與相同濃度鼠血清對照組相比，10%、15%、20%的含藥血清細(xì)胞遷移抑制率增大（P＜0.05，P＜0.01），且隨濃度增加遷移抑制率增大。說明健脾消癌方能夠抑制HCT116細(xì)胞遷移，與濃度呈正相關(guān)。見表2。

3.3 健脾消癌方對細(xì)胞侵襲的影響處理24 h后，與相同濃度鼠血清對照組相比，10%、15%、20%的含藥血清細(xì)胞侵襲抑制率增加（P＜0.05；P＜0.01），且隨濃度增加侵襲抑制率增高。說明健脾消癌方能夠抑制HCT116細(xì)胞侵襲，與濃度呈正相關(guān)。見表3。

表1 含藥血清對HCT116細(xì)胞遷移距離的影響（n＝3×5，±s）

表1 含藥血清對HCT116細(xì)胞遷移距離的影響（n＝3×5，±s）

注：與胎牛血清組比較，*P＜0.05，△P＜0.01；與相同濃度對照組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01；含藥血清48 h與24 h比較，○P＜0.05

組別0 h（l/cm）24 h（l/cm）48 h（l/cm）10%含藥血清組7.11±0.24 4.47±0.32*# 5.10±0.38△▲ 15%含藥血清組6.98±0.31 5.04±0.45*# 5.56±0.51△▲20%含藥血清組7.10±0.25 5.12±0.37*# 6.03±0.41△▲○10%對照鼠血清組7.22±0.36 3.56±0.39 0.55±0.36*15%對照鼠血清組6.80±0.34 3.20±0.40 0.38±0.30 20%對照鼠血清組6.86±0.25 2.95±0.31 0.15±0.23 10%胎牛血清組7.04±0.23 3.05±0.34 0.10±0.06

表2 健脾消癌方含藥血清對細(xì)胞遷移的影響（±s，n＝3）

表2 健脾消癌方含藥血清對細(xì)胞遷移的影響（±s，n＝3）

注：與胎牛血清組比較，*P＜0.05，△P＜0.01；與相同濃度對照組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01

/%10%含藥血清組2.21±0.15*組別OD值遷移抑制率21.9 15%含藥血清組2.17±0.23*#23.3 20%含藥血清組1.39±0.25△▲50.9 10%對照鼠血清組2.52±0.26 10.9 15%對照鼠血清組2.60±0.14 8.1 20%對照鼠血清組2.81±0.20 0.7 10%胎牛血清組2.83±0.18/

表3 健脾消癌方含藥血清對細(xì)胞侵襲的影響（±s，n＝3）

表3 健脾消癌方含藥血清對細(xì)胞侵襲的影響（±s，n＝3）

注：與胎牛血清組比較，*P＜0.05，△P＜0.01；與相同濃度對照組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01

/%10%含藥血清組0.79±0.14*組別OD值侵襲抑制率25.5 15%含藥血清組0.66±0.12△#37.7 20%含藥血清組0.54±0.15△▲49.1 10%對照鼠血清組0.94±0.11 11.3 15%對照鼠血清組0.97±0.13 8.5 20%對照鼠血清組1.02±0.10 3.8 10%胎牛血清組1.06±0.09/

3.4 健脾消癌方對MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響與15%鼠血清對照組比較，15%的含藥血清細(xì)胞的MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。說明健脾消癌方能夠下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)。見表4，圖4。

表4 MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)水平（±s，n＝3）

表4 MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)水平（±s，n＝3）

注：與胎牛血清組比較，△P＜0.01；與相同濃度對照組比較，▲P＜0.01

-actin 15%含藥血清組0.58±0.04△▲0.34±0.02組別MMP-2/β-actin MMP-9/β△▲15%對照鼠血清組1.06±0.02 0.58±0.03△10%胎牛血清組1.11±0.03 0.72±0.02

圖4 MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平

4 討論

大腸癌屬于中醫(yī)學(xué)“腸覃”“腸癖”“臟毒”“癥瘕”“鎖肛痔”等范疇。我院腫瘤中心長期從事中醫(yī)藥抗結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移臨床及基礎(chǔ)研究，總結(jié)腸癌基本病機為“脾虛、瘀積、癌毒”，當(dāng)以健脾益氣，化瘀解毒為治療法則。擬定健脾消癌方，主要藥物組成有人參、薏苡仁健脾益氣，郁金、莪術(shù)活血化瘀，重樓、半枝蓮清熱解毒，全方配伍，寒溫并用，標(biāo)本兼顧，攻補兼施。

轉(zhuǎn)移是引起腫瘤患者死亡的主要原因［13］。腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移能力與癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。單個腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫落游離是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的第一步，腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞之間黏附因子的損失是腫瘤細(xì)胞脫離的要素。脫落的腫瘤細(xì)胞即為循環(huán)腫瘤細(xì)胞，與脈管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞黏附，遷移到特定的組織器官，并發(fā)展成為繼發(fā)癌灶的過程，即是轉(zhuǎn)移。遷移是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中必不可缺的環(huán)節(jié)之一［14］。故抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵之一乃是抑制腫瘤細(xì)胞向外遷移。

MMPs是一類高度保守的鋅原子依賴內(nèi)肽酶家族，大部分成員具有降解細(xì)胞基膜及細(xì)胞外基質(zhì)功能，是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的重要分子。MMPs在腫瘤轉(zhuǎn)移的多個步驟均有參與，包括腫瘤的遷移、侵襲、免疫逃逸、血管的生成、腫瘤的生長［13］。MMP-2和MMP-9是MMPs的明膠酶組成員，通過降解基底膜的膠原成分、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞黏附分子，促進血管生成和調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞運動性增強，促進癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［15-17］。端傳友［18］檢測86例結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平及陽性率均顯著高于正常結(jié)腸組織，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中MMP-2、MMP-9陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示MMP-2、MMP-9高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。故通過降低MMP-2及MMP-9的表達(dá)，可以抑制腫瘤細(xì)胞的脫落、遷移，從而降低轉(zhuǎn)移率。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健脾消癌方能夠抑制細(xì)胞遷移及侵襲，并下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平，健脾消癌方抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機制可能是通過下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，從而抑制HCT116細(xì)胞遷移、侵襲力。