中醫(yī)藥抑制葡萄球菌生物膜形成及機(jī)制研究進(jìn)展*

于進(jìn)洋，韓旭，譚紅略

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州450046；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；3.河南省正骨研究院，河南洛陽(yáng)471002

葡萄球菌屬革蘭氏陽(yáng)性菌屬，其中大多數(shù)無(wú)致病性，但金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，SA）及表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis，SE）作為葡萄球菌的主要菌種，具有較強(qiáng)的致病性［1］。研究顯示，葡萄球菌尤其是耐藥葡萄球菌所致的臨床難治性感染超過(guò)80%的病例與細(xì)菌生物膜的形成相關(guān)［1-2］。細(xì)菌生物膜是指細(xì)菌在極其嚴(yán)苛的生長(zhǎng)條件下，為了保護(hù)自己不受周圍環(huán)境的影響，附著在生物或者非生物體的表面，包裹在其分泌的胞外聚合物基質(zhì)中，形成可以適應(yīng)周圍多樣性環(huán)境的細(xì)菌群體，是細(xì)菌生存的一種特殊形式［3-4］。細(xì)菌生物膜的形成可以分為3個(gè)階段，即初始附著階段、聚集成熟階段和最后的脫落播散階段，其形成受群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing，QS）和相關(guān)的細(xì)胞因子調(diào)控，是一個(gè)精密而復(fù)雜的過(guò)程［5］。細(xì)菌生物膜的形成增強(qiáng)了細(xì)菌的耐藥性，生物膜屏障下的細(xì)菌對(duì)抗生素的抗性是浮游細(xì)菌的1000倍，高耐藥性使得葡萄球菌所致的感染往往遷延難愈［6］。尋求抑制葡萄球菌生物膜形成的方法成為治療難治性感染的關(guān)鍵所在。

近年來(lái)，隨著對(duì)中醫(yī)藥資源的不斷發(fā)掘，中藥在治療葡萄球菌生物膜導(dǎo)致的難治性感染方面顯示出較為明顯的優(yōu)勢(shì)，且由于中藥方便獲取、不良反應(yīng)小、價(jià)格較抗生素便宜、不易導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥等優(yōu)點(diǎn)，已成為繼抗生素之后抗感染的重要途徑和研究方向之一［7-8］。本文就中醫(yī)藥抑制葡萄球菌生物膜形成的效用及機(jī)制的研究進(jìn)展綜述如下。

1 中醫(yī)藥對(duì)于葡萄球菌生物膜形成的抑制作用

1.1 單味中藥提取物目前，隨著藥物研究水平的不斷提高，發(fā)現(xiàn)許多單味中藥的提取物具有明顯的抗感染作用，對(duì)葡萄球菌生物膜的形成有不同程度的抑制效用。何谷良等［9］研究黃芩提取物黃芩苷對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA）的影響，結(jié)果表明，黃芩苷對(duì)MRSA的最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）、最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）及最小生物膜清除濃度（minimum biofilm eradication concentration，MBEC）分別為1 g·L-1、0.5 g·L-1和0.5 g·L-1，說(shuō)明黃芩苷不僅可以抑制MRSA，還對(duì)其生物膜有清除作用。李玲等［10］研究小檗堿（黃連素）對(duì)MRSA的抑制作用，發(fā)現(xiàn)小檗堿對(duì)MRSA的MBC、MIC及MBEC分別為0.4 g·L-1、0.2 g·L-1和0.2 g·L-1，說(shuō)明小檗堿不僅對(duì)MRSA的增殖具有抑制作用，而且對(duì)其生物膜的形成也有著一定的抑制作用。汪倫記等［11］研究了在不同添加時(shí)間和不同質(zhì)量濃度下冬凌草提取物對(duì)SA生物膜形成的抑制作用，結(jié)果表明，冬凌草提取物對(duì)SA生物膜抑制作用的強(qiáng)弱與添加時(shí)間成反比，而與質(zhì)量濃度成正比，即在SA生物膜形成初始階段添加高濃度（＞1MIC）冬凌草提取物對(duì)生物膜的清除效果最佳。馮韜等［12］通過(guò)觀察6種中藥提取物對(duì)SA生物膜形成的影響發(fā)現(xiàn)，在液體濃度為1MIC時(shí)，蒲公英、板藍(lán)根和白頭翁3種中藥的醇提液對(duì)生物膜的抑制率都高于80%，但在1/16 MIC或1/32MIC的低濃度下，大青葉和白頭翁的水提液以及大青葉和柴胡的醇提液卻有利于生物膜的形成。崔新潔等［13］研究24味中藥的水提液對(duì)SA的抑菌作用發(fā)現(xiàn)，連翹、蒲公英、淫羊藿、蜂房、毛冬青、高良姜、牡丹皮、苦參、吳茱萸、姜黃、附子、菟絲子、肉豆蔻、金銀花、肉桂、冰片、當(dāng)歸、杜仲、魚(yú)腥草、天冬20種中藥的水提液對(duì)SA的MIC均≥200 g·L-1，對(duì)SA生物膜的抑制作用差；五倍子、蘇木、黃芩及丹參的水提液對(duì)SA的MIC分別為0.39 g·L-1、12.5 g·L-1、50 g·L-1及100 g·L-1，對(duì)生物膜的抑制作用較好；五倍子和黃芩的水提液在1/2MIC和1/4MIC的濃度時(shí)就能很好地起到抑制生物膜的效果，同時(shí)可以較好地起到清除生物膜的作用?；艏验龋?4］通過(guò)研究蒲公英水提液對(duì)SA生物膜形成的影響發(fā)現(xiàn)，蒲公英水提液在1/2MIC、1MIC、2MIC的濃度下對(duì)SA生物膜有清除作用，且濃度越高，清除作用越大。喻華英等［15］探討甘草提取物對(duì)SA生物膜的影響，結(jié)果表明，低濃度條件下的甘草提取物有利于生物膜的生長(zhǎng)，高濃度條件可抑制生物膜的形成和生長(zhǎng)。朱明等［16］研究了新疆黑蜂膠提取物對(duì)SA生物膜的影響，結(jié)果顯示當(dāng)MIC為6.25 g·L-1時(shí)，黑蜂膠提取物可抑制SA生物膜的形成，且高濃度的黑蜂膠提取物可破壞成熟的SA生物膜，其抗菌活性甚至可等效于青霉素。

對(duì)單味中藥的水煎液也有相應(yīng)的研究。李延榮等［17］探討了新疆的鹽穗木、苦豆子、甘草、醉馬草4種特色植物的水煎液對(duì)SA生物膜的影響，研究表明，甘草、鹽穗木水煎液在低濃度時(shí)對(duì)SA的生長(zhǎng)沒(méi)有影響，但可抑制其生物膜的形成；高濃度時(shí)，不僅可以影響SA的生長(zhǎng)，還可以抑制其生物膜的形成，甚至對(duì)生物膜具有清除能力；醉馬草和苦豆子水煎液可以抑制SA生物膜的形成但不能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。裴金樂(lè)［18］研究金銀花水煎液對(duì)SE的抑制作用發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MIC為125 g·L-1時(shí)，金銀花水煎液對(duì)SE的抑制作用開(kāi)始顯現(xiàn)，但當(dāng)MIC為250 g·L-1時(shí)，金銀花對(duì)SE的抑制作用達(dá)到頂峰，不再增加。上述研究可以發(fā)現(xiàn)，單位中藥的提取物及水煎液對(duì)葡萄球菌生物膜有較好的抑制作用，且因其實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、成分單一，更有利于中藥活性成分的發(fā)掘，是當(dāng)前中藥抑制生物膜的研究熱點(diǎn)。

1.2 中藥復(fù)方當(dāng)前，中醫(yī)藥對(duì)臨床感染性疾病研究所運(yùn)用的中藥復(fù)方多是對(duì)經(jīng)典經(jīng)方的繼承或當(dāng)代名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方，只要臨床辨證準(zhǔn)確，療效是確切的。許多方藥對(duì)于體外抑制葡萄球菌生物膜的形成有效。新加達(dá)原散（清透方）由溫病大家吳又可、楊栗山的名方達(dá)原飲、升降散及經(jīng)方小柴胡湯方加減而成，有涼血解毒、開(kāi)達(dá)膜原之功效。左雪［19］通過(guò)初步探索新加達(dá)原散對(duì)SA的抵抗作用發(fā)現(xiàn)，新加達(dá)原散不僅在SA生物膜形成的初期抑制其形成，在生物膜成熟后還可進(jìn)入其內(nèi)部對(duì)膜內(nèi)細(xì)菌進(jìn)行殺滅。復(fù)方白玉散為名老中醫(yī)劉再朋的經(jīng)驗(yàn)方，針對(duì)難愈性創(chuàng)面具有解毒斂瘡之功效。姚孝明等［20］研究復(fù)方白玉散濃縮溶液對(duì)SA的體外抑菌作用發(fā)現(xiàn)，該方對(duì)SA生物膜的形成有抑制作用，且對(duì)SA有抑制和殺滅作用。

除了對(duì)復(fù)方湯劑研究外，文獻(xiàn)對(duì)復(fù)方注射劑、散劑及水提液對(duì)葡萄球菌生物膜的影響也有深入的研究。痰熱清注射液由5種中藥組合而成，可用于治療風(fēng)溫肺熱之痰熱阻肺證。劉鈺玲［21］研究痰熱清對(duì)MRSA的作用發(fā)現(xiàn)，痰熱清對(duì)MRSA生物膜的生長(zhǎng)及成熟階段均有抑制作用，且可以穿透生物膜，通過(guò)殺菌效用減少膜內(nèi)的活菌數(shù)量。Wang等［22］也對(duì)痰熱清對(duì)于SA生物膜的作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)痰熱清可抑制SA生物膜的生長(zhǎng)，并可進(jìn)入膜中殺死活的細(xì)菌。脫管散是甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由宮粉、冰片、枯礬、輕粉和麝香5味中藥組成，外用治療瘡瘍潰爛等疾病療效明顯，有去腐生肌的功效。張秀［23］研究發(fā)現(xiàn)脫管散對(duì)SA生物膜的形成有抑制作用，在其成熟期還具有破壞作用。清開(kāi)靈顆粒有清熱解毒的功效，對(duì)于急性炎癥有良好的療效。李將等［24］研究結(jié)果表明，當(dāng)清開(kāi)靈藥液濃度在3.9～62.4 g·L-1濃度區(qū)間時(shí)，濃度越高，對(duì)SA生物膜的破壞作用越強(qiáng)。韓雪等［25］也對(duì)清開(kāi)靈注射液抑制SA生物膜的作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)清開(kāi)靈可以破壞SA生物膜結(jié)構(gòu)，使其生物膜變得疏松，與青霉素相比，其對(duì)成熟期的生物膜有更強(qiáng)的破壞力。連花清瘟膠囊作為中成藥，有良好的抗病毒作用，治療流感及呼吸道感染有較好的療效。王藝竹等［26］探討了連花清瘟膠囊水提物對(duì)MRSA細(xì)菌生物膜的影響，研究表明，在濃度為173～10.81 g·L-1時(shí)，連花清瘟水提物對(duì)MRSA的生物膜形成有抑制作用，而濃度為173 g·L-1時(shí)，可使MRSA生物膜變薄，并且顯著殺滅膜內(nèi)細(xì)菌。雷洪濤等［27］對(duì)于連花清瘟膠囊抑制MRSA生物膜的作用做了研究，發(fā)現(xiàn)連花清瘟膠囊一方面可以對(duì)生物膜基質(zhì)進(jìn)行分解，破壞MRSA的細(xì)菌生物膜屏障，另一方面可以穿過(guò)生物膜對(duì)膜內(nèi)細(xì)菌進(jìn)行殺滅。上述研究可以發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方作為臨床最主要的中藥治療手段，其藥物組成復(fù)雜，不僅對(duì)生物膜的形成有抑制作用，而且大部分復(fù)方還對(duì)生物膜有清除作用。因此中藥復(fù)方在治療生物膜相關(guān)感染性疾病中應(yīng)用前景廣泛。

2 中醫(yī)藥抑制葡萄球菌生物膜形成的機(jī)制

SE和SA形成生物膜的能力是當(dāng)前內(nèi)置物感染難以治療的重要因素。隨著對(duì)細(xì)菌生物膜機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌生物膜形成的分子基礎(chǔ)及調(diào)控因子主要是多糖胞間黏附素（polysaccharide intercellular adhesin，PIA）、胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）、細(xì)胞壁錨定蛋白（cell wall-anchored proteins，CWA）、QS、酚溶性調(diào)控蛋白（phenol-soluble modulins，PSMs）和全局性調(diào)控因子（carbon storage regulator，CsrA）等［28］。由此可見(jiàn)，細(xì)菌生物膜的形成機(jī)制極其復(fù)雜。目前，中藥單體及其復(fù)方對(duì)于葡萄球菌生物膜作用的研究大都停留在表象，只有少部分研究與葡萄球菌生物膜形成的機(jī)制相關(guān)。

2.1 中藥單體苦參總堿是從苦參中提取的活性成分，有抗炎、抗病毒的功效，可用于感染疾病的治療。王李俊等［29］體外培養(yǎng)SE細(xì)菌生物膜，觀察苦參總堿對(duì)生物膜的抑制作用，并探索其作用機(jī)制，結(jié)果表明苦參總堿對(duì)SE生物膜的形成有明顯抑制作用，其作用機(jī)制是對(duì)SE氧化應(yīng)激響應(yīng)基因gpsA-2和serp2195（分別編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶和編碼谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，是具有消除氧化壓力作用和還原過(guò)氧化物的2種蛋白酶）表達(dá)具有下調(diào)作用。丹參酮類化合物是丹參的主要有效成分，而丹參酮類化合物中的有效單體成分隱丹參酮對(duì)浮游的SE有清除作用。易輝等［30］以萬(wàn)古霉素為對(duì)照探討了亞抑菌濃度下隱丹參酮對(duì)SE生物膜形成的作用，結(jié)果表明，萬(wàn)古霉素和隱丹參酮對(duì)SE的MIC分別為4 mg·L-1和2 mg·L-1。MIC下的萬(wàn)古霉素和隱丹參酮均能抑制SE生物膜的基質(zhì)量、自溶素基因表達(dá)和膜內(nèi)菌代謝活性，而且同在亞抑菌濃度下，隱丹參酮的抑制作用明顯強(qiáng)于萬(wàn)古霉素。熊果酸又名烏蘇酸，是一種天然萜類化合物，廣泛存在于具有抗炎作用的天然植物中，如野木瓜、熊果及夏枯草等，有一定的抗菌、抗炎和抗病毒作用［31］。李洋等［32］研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MIC為0.27 mmol·L-1時(shí)，熊果酸可對(duì)SA生物膜早期的形成有抑制作用，其機(jī)制可能為抑制胞外多糖的合成，而且熊果酸與左氧氟沙星聯(lián)合用藥可增強(qiáng)對(duì)SA生物膜的抑制作用，破壞其完整性。和厚樸酚是從中藥厚樸中提取的主要活性成分，有抗菌和抗炎作用。喬瑞紅等［33］研究了和厚樸酚抑制MRSA生物膜生長(zhǎng)及成熟時(shí)期的作用機(jī)制，結(jié)果表明，不論生物膜處于生長(zhǎng)階段還是成熟階段，和厚樸酚都有較好的抑制效果，其機(jī)制是通過(guò)抑制eDNA和PIA的合成產(chǎn)生影響，達(dá)到抑制生物膜形成的目的。此外，和厚樸酚還可通過(guò)調(diào)控細(xì)菌QS系統(tǒng)的附屬基因調(diào)節(jié)子（accessory gene regulator A，agrA）的表達(dá)量影響生物膜的形成。鹽膚木，又稱五倍子樹(shù)，其樹(shù)葉的乙醇提取物有一定的抗炎、抗菌作用。You等［34］研究了鹽膚木乙醇提取物對(duì)MRSA生物膜的影響，結(jié)果表明，當(dāng)其提取物MIC高于0.05 g·L-1時(shí)，對(duì)MRSA生物膜有顯著的清除作用，而且還可通過(guò)影響agrA和輔助調(diào)節(jié)子（staphylococcal accessory regulator A，sarA）等生物膜相關(guān)基因表達(dá)對(duì)生物膜產(chǎn)生抑制作用。上述研究可以發(fā)現(xiàn)，中藥單體對(duì)于抑制生物膜機(jī)制探究有一定的成果，但是探討相對(duì)模糊，需要更深層次的挖掘。

2.2 中藥復(fù)方鼻淵舒口服液由清膽瀉熱的代表方吉雷開(kāi)竅湯加減而成，藥物以清熱藥黃芩、梔子為主，有清除膽腑郁熱的功效。曹劉［35］在對(duì)鼻竇炎的治療中研究了鼻淵舒口服液對(duì)于SE生物膜相關(guān)agrA和luxS基因的調(diào)控，結(jié)果表明，鼻淵舒口服液對(duì)SE生物膜有明顯的抑制作用，其作用機(jī)制主要是通過(guò)上調(diào)luxS基因降低自身誘導(dǎo)信號(hào)分子-2（autoinducer-2，AI-2）的信號(hào)，負(fù)調(diào)控達(dá)到成膜抑制效果；下調(diào)agrA基因，正調(diào)控達(dá)到抑膜效果；對(duì)altE基因的調(diào)節(jié)既有上調(diào)也有下調(diào)，表明鼻淵舒口服液并非通過(guò)agr-altE通路的單一線性調(diào)節(jié)影響SE生物膜的形成。復(fù)方四黃外洗液由《肘后備急方》中的黃連解毒湯加減而成，有清熱解毒、去腐生肌的功效，可治療以火毒、熱毒為證候的瘡瘍病。陳曉堅(jiān)［36］研究了復(fù)方四黃外洗液對(duì)MRSA生物膜形成的抑制作用，結(jié)果表明，復(fù)方四黃外洗液可顯著抑制MRSA生物膜的形成，其作用機(jī)制可能為通過(guò)阻礙細(xì)菌的黏附、生長(zhǎng)以及胞外多糖的分泌，從而抑制或推遲生物膜的形成。綜上可以發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方對(duì)于生物膜作用突出，但其成分復(fù)雜，對(duì)機(jī)制探討的基礎(chǔ)研究相對(duì)較少，需進(jìn)一步加強(qiáng)。

3 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，隨著臨床上抗生素的大幅使用甚至濫用，細(xì)菌耐藥問(wèn)題越發(fā)嚴(yán)重，多重耐藥菌株的出現(xiàn)更加提醒人們要引起重視［37］。細(xì)菌耐藥究其原因主要是生物膜的形成，生物膜保護(hù)膜內(nèi)的細(xì)菌，使其免于宿主及抗生素的攻擊，使感染性疾病遷延難愈。當(dāng)前有關(guān)中醫(yī)藥抑制葡萄球菌生物膜形成的基礎(chǔ)研究相對(duì)較少，與骨科內(nèi)植物細(xì)菌生物膜形成相關(guān)的基礎(chǔ)研究更少；同時(shí)，對(duì)其復(fù)雜作用機(jī)制的研究也相對(duì)較為薄弱，且文獻(xiàn)多是探討單純中藥單體或復(fù)方的報(bào)道。而臨床實(shí)際治療感染是抗生素與中醫(yī)藥的辨證結(jié)合。針對(duì)骨科臨床，往往也是全身或局部抗生素與中藥方的全身或局部的組合應(yīng)用。因此，針對(duì)骨科臨床常見(jiàn)的局部骨關(guān)節(jié)感染，除了加強(qiáng)對(duì)單純的中藥復(fù)方或單體抑制葡萄球菌生物膜形成的基礎(chǔ)研究外，更應(yīng)該關(guān)注組合抗生素情況下對(duì)生物膜形成的影響；同時(shí)，深入探討中醫(yī)藥單用及組合抗生素應(yīng)用抑制葡萄球菌生物膜形成的機(jī)制，為與骨科內(nèi)植物細(xì)菌生物膜形成的相關(guān)感染性疾病的治療提供思路。